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http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 美罗培南HPLC药物分析 AnalChem.211 4/25/2020 3:56 AM 2020年4月25日星期六3时56分50秒 让我们记住willon等人在2005年秋2个月的辛勤工作。 提 纲 美罗培南简介 条件试验 方法学 有关物质检查与含量测定 美罗培南(meropenem) 简 介 美罗培南：非肠道的注射用抗生素 对阳性和阴性革兰氏病原体有抗菌作用； 加热时分解，得到开环物 。 Meropenem (300 mg) USP Retail Price: $189.00 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 提 纲 美罗培南简介 条件试验 方法学 有关物质检查与含量测定 实验仪器及工作条件 1、仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪 50ul微量注射器 pH计，砂芯漏斗，针孔过滤器 2、试剂 乙腈（色谱专用） 三乙胺（A.R.） 浓磷酸（A.R.） 美罗培南试样 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 实验仪器及工作条件 3、HPLC分析条件 色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-C8 4.6×150mm,5µm(Agilent) 柱温：室温 流动相：0.3%三乙胺(用磷酸调节pH=5.0)的水溶液和乙腈(体 积比100∶7)；也可以简化用纯水和乙腈(体积比100∶7)作流动相 检测器：DAD 检测波长：220nm 进样体积：20µl定量环，实际每次注射40µl Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 可不是件容 易事啊！ http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 提 纲 美罗培南简介 条件试验 方法学 有关物质检查与含量测定 方法学研究 1、空白试验 2、美罗培南与BP及开环物的分离 3、美罗培南检测限、定量限 4、破坏性试验 5、溶液稳定性 6、工作曲线 7、样品的有关物质检测和含量测定 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 1、 空白试验 空针进样：基线是否稳定 流动相进样：是否有杂质影响 注 意 纵 轴 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 色谱法中的信噪比 A (mAU) 较小波长处： 信号和噪声均大 上：199nm N = 4 mAU 常识大 800 600 -0.04 A (mAU) 1400 1200 1000 40 45 32 34 36 38 40 t (min) 400 210 230 250 λ (nm) 270 290 310 DEP为例,典型UV吸收光谱 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 A (mAU) 下：275nm N = 0.02 mAU -0.06 200 0 190 35 t (min) -0.5 -0.6 30 -0.7 -0.8 -0.9 -1 -1.1 -1.2 -1.3 中：228nm N = 0.35 mAU A(mAU) -4 -5.5 30 -7 -8.5 -10 -11.5 -13 -14.5 -16 34.9 35.4 35.9 36.4 -0.08 -0.1 -0.12 t (min) http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ A (mAU) 1.5 mg/L 的DEP -4 -5.5 30 -7 -8.5 -10 -11.5 -13 -14.5 -16 A (mAU) 色谱法中的信噪比 -0.5 -0.6 30 -0.7 -0.8 -0.9 -1 -1.1 -1.2 -1.3 199nm S = 58.8 mAU S/N = 14.7 228nm S = 18.3 mAU S/N = 52.3 35 40 45 t (min) 32 34 36 38 40 t (min) -0.04 -0.06 A (mAU) 275nm S = 2.18 mAU S/N = 109 34.9 35.4 35.9 36.4 -0.08 -0.1 -0.12 t (min) Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 缓冲溶液对峰形的改善 使用缓冲溶液 不使用缓冲溶液 原因分析： Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 2、美罗培南与BP及开环物的分离 美罗培南与中间产物BP分离 流动相改用50%乙腈：50%纯水 折腾好 几天啊 BP BP 美罗培南 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 美罗培南与BP光谱比较 1.6 1.4 多波长检测+ 1.2 1 化学计量学 0.8 BP 20ng/ml 0.6 0.4 美罗培南 20ng/ml 0.2 0 190 210 230 250 270 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 290 310 330 350 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 美罗培南与开环物分离 计算分离度，理论塔板数 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 3、美罗培南测出限、测定限 测出限(LOD:S/N=3) 测定限(LOQ:S/N=10) 稀释多次 减少污染 LOD： 0.19 mg/L LOQ： 0.62 mg/ml Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 4、破坏性试验(1) 酸破坏 25mg美罗培南，加0.1mol/L HCl 5ml，室温振摇溶解后反应液用 0.1mol/L NaOH中和至中性进样 主峰84% Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 4、破坏性试验(2) 碱破坏 25mg美罗培南，加0.01mol/L NaOH 5ml， 振摇溶解，室温放置34min后反应液用 0.01mol/L HCl中和至中性进样。 主峰95.5% Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 4、破坏性试验(3) 氧化破坏 25mg美罗培南，加1％双氧水1ml，振摇， 室温放置14min，加热分解剩余的双氧水， 加流动相至5ml过滤后进样。 主峰 83.33% Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 今 天 网 络 讨 论 ： 为 什 么 要 破 坏 性 试 验 ？ 4、破坏性试验(4，5， 6) 高温/光照/高湿 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 主峰 98.08% 高温破坏 主峰 98.50% 光照破坏 主峰 96.59% 高湿破坏 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 5、溶液稳定性 溶液室温放置6h，过程中取样测试稳定性 面积百分比 面积百分比 102 102 0.5mg/ml 101 100 100 99 99 98 98 97 97 96 稀溶液较稳定 95 94 5mg/ml 101 96 95 94 0 100 200 300 400 时间/min 0 100 200 300 400 时间/min 试验溶液要现配现做，尤其是浓溶液！ Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 6、工作曲线 美罗培南（0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0） mg/ml 主峰面积作图 R要求0.999 16000 y = 13945x + 398.62 2 R = 0.9998 14000 12000 10000 8000 好高的要求, 称得要准阿! 6000 4000 2000 0 0.0000 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 0.2000 0.4000 0.6000 0.8000 1.0000 1.2000 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 7、样品有关物质检测和含量测定 有关物质检测 粗品、040901-1、040901-2、040901-3、 041001、041002、041003 含量测定 USP好贵啊！ 041001、041002、041003 先以USP对照品标定040901-3批 以后都以040901-3为对照品 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 提 纲 美罗培南简介 条件试验 方法学 有关物质检查与含量测定 有关物质检查和含量测定 1、方法步骤 A 有关物质检测 供试品溶液：5mg/ml，用流动相溶解。 对照溶液：将供试品溶液用流动相稀释制成25µg/ml （1：200）。 记录色谱图至主成分峰保留时间的3.5倍 目的：相同坐标刻度范围看杂质含量 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 有关物质检测（040901-3批） 峰高占满刻 度20%-25% 25ug/ml 坐标刻度 范围相同 5mg/ml Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ B 含量测定 供试品溶液：0.5mg/ml，用流动相溶 解 对照品溶液：0.5mg/ml，用流动相溶 解 计算方法：外标法（单点校正） 对照品均为：040901-3批 平行进样至少2针 目的：测试物质含量 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 含量测定（040901-3批） 对照品 USP 供试品 040901-3批 1st A：7199 1st nd 2A：7602 A：7612 供试品 040901-3批 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 2nd A：7612 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 2、工作内容 影响因素实验样品测定 光照、高温、高湿度考核：5天，10天 长期试验样品（25℃、RH60%） 3月，6月，9月，12月 加速试验样品（40℃、RH75%） 1月，2月，3月，6月 加速试验样品（30℃、RH60%） 1月，2月，3月，6月 注意：以上试验分别测试041001、041002、041003批 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 后续工作展望 半成品、成品试剂等方法学研究及 有关物质检测和含量测定 Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/ 路漫漫兮其修远兮！ Laozhu的地盘，laozhu的讲稿 http://chemcenter.tongji.edu.cn/bbs/