Transcript predavanje 2

Tehnike u čijoj je osnovi
interakcija antigen-antitelo
Testovi za ANTIGEN-ANTITELO REAKCIJE
A. Faktori koji utiču na merenje antigen-antitelo reakcije
B. Testovi Aglutinacije
1. Aglutinacija/Hemaglutinacija
a. Kvalitativni test aglutinacije
b. Kvantitativni test aglutinacije
c. Primena testa aglutinacije
2. Pasivna hemaglutinacija
3. Coomb's Test (Antiglobulinski test)
a. Direktan Coomb's Test
b. Indirektan Coomb's Test
c. Primena
4. Inhibicija Hemaglutinacije
C. Testovi Precipitacije
1. Radijalna Imunodifuzija (Mancini)
2. Imunoelektroforeza
3. Protiv strujna elektroforeza
D. Radioimmunoassay (RIA)/Enzyme Linked Immunosorbent Assay
(ELISA)
1. Kompetitivna RIA/ELISA za detekciju Ag
2. Nekompetitivna RIA/ELISA za Ag ili At
E. Testovi za ćelijske antigene
1. Imunofluorescenca
a. Direktna Imunofluorescenca
b. Indirektna Imunofluorescenca
c. Protočna citofluorimetrija
F. Fiksacija komplenta
Tip reakcije antigena i antitela zavisi
od prirode antigena
 Solubilni antigen –
imunoprecipitacija
 Partikularni antigen –
imunoaglutinacija
Imunotestovi sa obeleženim
antigenom ili antitelom
Radioimunotestovi (RIA)
Enzimimunotestovi (ELISA)
Imunohistohemijske tehnike
formiranje velikih nesolubilnih imunskih
kompleksa nije neophodno
Testovi za ćelijske antigene
formiranje velikih nesolubilnih imunskih
kompleksa nije neophodno
Imunohistohemijske tehnike
 Imunoenzimske tehnike
• Tehnika imunoperoksidaznog bojenje
• Tehnika imnuoalkalnonofosfataznog bojenja
 Imunoflorescenca
• Direktna
• Indirektna
• Protočna citofluorimetrija
Metode bazirane na
komplementu
formiranje velikih nesolubilnih imunskih
kompleksa nije neophodno
Test fiksacije komplementa
Koristi se za dokazivanje infekcije. Određuje se prisustvo specifičnog At ili Ag
Koriste se eritrociti ovce, anti-eritrocitna At i komplement, plus specifičan antigen
(ukoliko se ispituje At u serumu) ili specifično At (ukoliko se ispituje Ag u serumu).
Ako je At ili Ag prisutan u serumu pacijenta, onda je komplement potpuno iskorišćen
tako da eritorciti nisu lizirani.
Ali ako At ili Ag nisu prisutni onda komplement nije iskorišćen tako da se vezuje za a
eritrocitna At i dovodi do lize eritrocita.
Wassermann-ov test je jedna forma testa fiksacije komplementa.
nema Ag
Ag
Ag
serum
pacijenta
Ag
I) Imunoglobulini i drugi serumski proteini





Abnormalnosti serumskih imunoglobulina pojavljuju se u
autoimunskim
infektivnim
imunodeficijentnim i
limfoproliferativnim poremećajima
 Kvalitativne, kvantitativne i funkcionalne procene
serumskih imunoglobulina
Testovi za procenu humoralnog imuniteta u
kliničkoj praksi

Mehanizmi molekulskih interakcija značajne za
ostvarivanje funkcija humoralnog imunskog odgovora:



kvantitativno određivanje koncentracija
imunološka identifikacija
karakterizacija

Određivanje ukupnih proteina

Biuretska, tanin turbidimetrijska, metoda taloženja
trihlorsirćetnom kiselinom i dr

Elektroforetske tehnike

Metoda po Grabar-Williams-u ili mikrozonska elektroforeza po
Shidigger-u, na acetatnoj celulozi ili agaroznom gelu
 Serumske elektorforeze (jednostavna, jeftina, brza tehnika)
obezbeđuje informacije o povećanju i smanjenju ukupnih
serumskih imunoglobulina i prisustvu monoklonskih traka
 Karakterizacija – imunofiksacija
 Kvantifikacija klasa imunoglobulina – nefelometrija
 Funkcionalna aktivnost – merenje izoaglutinina (IgM)
 Zonska elektroforeza (semikvantitativna)
 Karakterizacija paraproteina (patološki proteini) –
imunoelektroforeza i imunofiksacija
 Kvantifikacija paraproteina – kvantifikacijom imunoglobulina,
denzitometrijom (Bence-Jones proteini)
 Kvantifikacija imunoglobulina i drugih proteina
 Radijalna imunodifuzija (RID)
 Nefelometrija
 Kvantifikacija IgG klasa
 RID, ELISA, nefelometrija
II) Komplement i imunski kompleksi
 Rekurentne bakterijske infekcije
 Autoimunske bolesti sa prominentnim imunski kompleks
interakcijama






Test titracije komplementa (hemolitički test-CH50/100)
C3, C4 i properdin kvantifikacija
C3 nefrotski faktor
C1 esteraze inhibitor
C1q vezujući metod za imunske komplekse
cirkulišući imunski kompleksi
III) Autoimunska serologija
 Autoantitela u tkivima ili serumu
 Indirektna imunofluorescenca (ANA, tkivna autoantitela i
anti-neutrofilna citoplazmatska antitetla-ANCA)
 Aglutinacija (tiroidna antitela, RF)
 Imunoprecipitacija (ENA-antitela specifična za
ekstraktabilni nuklearni antigen, antitela specifična za ds
DNK i nuklearne antigene)
 RIA (anti-ds DNK antitela) i ELISA
Indirektna imunofluorescenca
 ANCA-Wegener-ova granulamatoza
 Antitela specifična za ACH receptor (Miastenija gravis)
 ANA – sistemske reumatske bolesti (SLE, polimozitis,
skleroderma, Sjogren-ov sindrom), reakcije na lekove,
hronične infekcije, RA i druge autoimunske bolesti
 Anti-fosfolipidna antitela – anti-fosfolipidni sindrom
 RF (IgM, IgA ili IgG)
IV) Fenotipizacija ćelija i funkcionalni testovi
 Imunski sistem je kontrolisan velikim brojem ćelija i u
dobro balansiranom imunskom sistemu ove ćelije
međusobno efikasno interaguju
 U imunološkim bolestima taj odnos je poremećen
 Identifikacija ćelija – fenotipska analiza
 Određivanje njihove funkcije ili funkcionalnog potencijala
– in vitro funkcionalni testovi
V) Citokini, inflamatorni pokazatelji i
tumorski markeri
 Citokini i solubilni citokinski receptori
 ELISA
 ELISA –spot
 Merenje mRNK
 Inflamtorni pokazatelji




Serumska elektroforeza
CRP - nefelometrija
SE
Kvantifikacija serumskog β2-mikroglobulina (RID, ELISA)
 Tumorski markeri
 RIA, ELISA, imunofluorescenca (tkiva)
VI) Imunohistologija
 Za identifikaciju ćelijskih antigena i produkata na
presecima tkiva
 Svetlosni, elektronski ili florescentni mikroskop
 Direktna
 Indirektna
 Pozitivne i negativne kontrole
AUTOANTITELA
* prisustvo autoantitela je uobičajeno povazano sa
imunopotologijom
* intezitet oštećenja je povezana sa količinom
autoantitela
* autoantitela su najčešće specifična za imunodominantne
epitope
Problemi:
* zdrave osobe sa prisutnim autoantitelima
* Osobe sa manifestacijama imunopatoloških bolesti, kod
kojih očekivana autoantitela nisu detektabilna
* nizak nivo autoantitela (IgM) može da bude povezan sa
infekcijom
* krosreaktivnost
DETEKCIJA AUTOANTITELA
INDIREKTNOM IMUNOFLUORESCENCOM
POZITIVAN REZULTAT
NEGATIVAN REZULTAT
(AUTO Ab+)
(AUTO Ab-)
EMISIJA SVETLOSTI
(FITC  ZELENA)
UV ZRACI
UV ZRACI
FLUOROHROM - KONJUGOVAN
ANTISERUM ZA HUMANI Ig
Y
ISPIRANJE
Y
ISPIRANJE
NEMA EMISIJE
ISPIRANJE
SERUM (AUTO Ab)
ISPIRANJE
AUTO Ag
ĆELIJE
STAKLO
VII) Alergije i hipersenzitivnost
 Reakcije preosetljivosti Tip I
 ukupni IgE (RIST)
 alergen specifični IgE (RAST)
 in vivo intradermalni test
 Reakcije preosetljivosti Tip II
 Coombs-ov test
 Reakcije preosetljivosti Tip III
 Autoantitela
 Reakcije preosetljivosti Tip IV
 Mantoux kožni test
 Funkcije T ćelija – proliferacija i produkcija citokina