Transcript Protočna citofluorimetrija

14. nedelja: Pitanja za ulazni test
1.
Šta su imunodeficijencije i kako se dele?
2.
Koje su imunodeficijencije prouzrokovane poremećajima komponenti urođene imunosti (primeri)?
3.
Koje su imunodeficijencije prouzrokovane poremećajima T- i B-limfocita (primeri)?
4.
Kako se određuje broj pojedinih populacija leukocita u perifernoj krvi?
5.
Kako biste u uzorku krvi pacijenta odredili broj, izdvojili i funkcionalno ispitali subpopulacije limfocita
(B-ćelije, pomoćničke T-ćelije, citotoksične T-ćelije)?
6.
Šta je to protočna citofluorimetrija i kakva je njena primena?
7.
Koji su osnovni markeri T-limfocita, B-limfocita i NK ćelija?
8.
Kako se indukuje i meri proliferacija T- i B-limfocita?
9.
Kako se određuju ukupni imunoglobulini u perifernoj krvi, a kako specifični imunoglobulini za određene antigene?
10. Šta su to provokacioni testovi, kožne probe rane i kasne preosetljivosti (primeri)?
Molimo vas da na sledeći seminar donesete:
1. Popunjen indeks
Šifra predmeta: IMUN
Naziv nastavnog predmeta: Imunologija
Godina: II
Status predmeta: O
ESPB: 3
Predavanja: 15
Vežbe: 10
Ostalo: 20
Molimo vas da na sledeći seminar donesete:
i
2. Popunjenu anketu o nastavi iz Imunologije
koja se nalazi odštampana u Priručniku za
nastavu iz Imunologije (poslednja strana)
Molimo vas da date i komentare
Ispitivanja ćelija imunskog
sistema
Ispitivanja ćelija imunskog sistema
 Izdvajanje ćelija
 Određivanje broja
 Funkcionalna ispitivanja in vitro
Izdvajanje MNĆ periferne krvi
pomoću gradijenta gustine
Krv
Limfoprep
Gustina
1.077 g/ml
Mononuklearne
ćelije
periferne krvi
centrifugiranje
Eritrociti i
Granulociti
Izdvajanje MNĆ periferne krvi
pomoću gradijenta gustine
Krv
Limfoprep
Gustina
1.077 g/ml
Mononuklearne
ćelije
periferne krvi
centrifugiranje
Eritrociti i
Granulociti
Razdvajanje ćelija pomoću paramagnetnih kuglica
MACS®
Heterogena populacija ćelija
inkubirana
sa
antitelima
UNakon
magnetnom
polju
obeležene
uklanjanja
magnetnog
obeleženim
česticama
ćelije
ostajumagnetnim
vezane
kolonu
a
polju
obeležene
ćelijezase
ispiraju
se nanosi
kolonu
od čelične
neobeležene
se ispiraju
i na
sakupljaju
vune
Određivanje broja ćelija
Na osnovu morfologije i bojenja

leukocitna formula iz komore i krvnog razmaza
Na osnovu veličine i granuliranosti

automatski brojači ćelija
Na osnovu specifičnih površinskih molekula

T-limfociti: CD3, CD4, CD8....

B-limfociti: Ig, CD19, CD20...

NK ćelije: CD16, CD56...
Protočni citofluorimetar
FACS®
Protočna citofluorimetrija
Smeša ćelija obeleženih fluorescentnim antitelima
Mlaz tečnosti koji
nosi fluorescentno
obeležene ćelije
Zelena fotomultiplikatorska
cev (PMT)
Crvena PMT
Granuliranost
Veličina
Protočna citofluorimetrija
Smeša ćelija obeleženih fluorescentnim antitelima
Mlaz tečnosti koji
nosi fluorescentno
obeležene ćelije
Zelena fotomultiplikatorska
cev (PMT)
Crvena PMT
Granuliranost
Veličina
Histogramski prikaz
Dot plot prikaz
Protočna citofluorimetrija (klinička primena)
 Imunofenotipizacija (identifikacija i kvantitiranje populacija i
subpopulacija limfocita)
 Karakterizacija ćelija kod limfoproliferativnih bolesti, tumora i
imunodeficijencija
 Određivanje produkcije reaktivnih oblika kiseonika i azota
 Određivanje sadržaja DNK (ćelijski ciklus)
Protočna citofluorimetrija (istraživačka primena)
Identifikacija aktivacionih molekula (npr. površinski
aktivacioni markeri, intracelularni Ca++, fosforilacija
intracelularnih proteina)
Detekcija specifičnih intracelularnih proteina (npr.
citokina)
Detekcija i kvantitiranje apoptoze ćelija
Funkcionalna ispitivanja fagocita
Hemotaksa
Adherencija
Ingestija
Respiratorni prasak
Intracelularno ubijanje
Funkcionalna ispitivanja NK ćelija
Citotoksičnost
Produkcija citokina
K 562
IFN-γ (ELISA)
Ispitivanje funkcija NK ćelija
Citotoksičnost (oslobađanje
Obeležavanje ciljnih
ćelija sa 51Cr
NK ćelije sa
obeleženim ciljnim
51Cr
K562)
Ubijene ćelije
oslobađaju 51Cr
Ispitivanje ćelija stečene imunosti
(T i B-limfocita)
 Određivanje broja ćelija
 Ispitivanje funkcionalnih svojstava
 T-ćelija
(proliferacija, produkcija citokina, citotoksičnost)
 B-ćelija
(proliferacija, produkcija antitela)
Ispitivanje funkcija T-limfocita
Proliferacija
Stimulacija:
 poliklonskim aktivatorima (mitogenima: PHA, ConA)
 antigenima
Meri se inkorporacijom 3H timidina u novosintetisanu DNK
Pacijent
medijum
ConA
A.B.
430±31
43905±389
D.G.
230±84
1200±227
Ispitivanje efektorskih funkcija
B i T-limfocita
 Produkcija antitela (B-limfociti)
(Nefelometrija, RID, ELISA)
 Produkcija citokina (T-limfociti)
(ELISA)
 Citotoksičnost (CTL)
(Citotoksični test)
Nakon ovog seminara možete da
odgovorite na sledeća pitanja
I
II
Kako se izdvajaju ćelije imunskog sistema?
 Izdvajanje na gustinskom gradijentu
 MACS®
 Protočna citofluorimetrija (FACS®)
Kako se određuju broj i fenotipske karakteristike ćelija
imunskog sistema?
 Diferencijalna leukocitna formula
 Protočna citofluorimetrija (FACS®)
III Kako se ispituju funkcije ćelija imunskog sistema in vitro?




Fagociti (hemotaksija, fagocitoza, respiratorni prasak, ubijanje)
NK ćelije (citotoksičnost, produkcija IFN-γ )
T-ćelije (proliferacija, citotoksičnost, produkcija citokina)
B-ćelije (proliferacija, produkcija antitela)
1. Izdvajanje ćelija iz krvi vrši se na osnovu a. produkcija citokina i citotoksičnost
2. Površinski markeri T-limfocita su
b. ELISA
3. Površinski markeri B-limfocita su
c. kod obolelih od hronične
granulomatozne bolesti
4. Površinski markeri NK ćelija su
d. citotoksičnim testom
5. Ubilačka aktivnost NK ćelija se određuje
e. razlike u gustini i površinskim
markerima
6. Respiratorni prasak fagocita je smanjen
f. CD3 i CD4 ili CD8
7. Efektorske funkcije T-ćelija su
g. membranski imunoglobulini, CD19,
CD20
8. Za merenje nivoa produkcije citokina
koristi se
h. nefelometrija, RID, ELISA
9. Za merenje količine antitela koriste se
10. Proliferacija T-limfocita se ispituje
1.__
e
2.__
f
3.__
g
4.__
j
5.__
d
i. stimulacijom sa T-ćelijskim mitogenima
j. CD16 i CD56
6.__
c
7.__
a
8.__
b
9.__
h
10.__
i
Sledeća nedelja
Predavanje
Sekundarne imunodeficijencije
Seminar
Prikaz kliničkih slučajeva