Transcript Bakteriofagi

Metode molekularne
genetike u direktnoj ili
indirektnoj detekciji
monogenskih bolesti
Podela tehnika
Analitičke tehnike
Preparativne tehnike
Hibridizacija DNK
Izolovanje DNK
Centrifugiranje
Elektroforeza
Enzimska digestija DNK
Rekombinovanje DNK
Kloniranje DNK
Umnožavanje DNK
Sekvenciranje DNK
Preparativne tehnike: Izolovanje
DNK
Maceriranje tkiva – mehaničko
 Razaranje ćelija

– Mehanička liza (sonikacija, smrzavanje,
mlevenje)
– deterdženti- SDS,
– Enzimi - lizozim, proteinaze
– Helirajući agensi – EDTA
– Redukujući agensi - DTT
Izvori biološkog materijala
Krv
 Semena tečnost
 Pljuvačka
 Urin
 Dlaka
 Zub
 Kost
 Bilo koje tkivo

Purifikacija DNK





Rastvaranje organskim rastvaračima
(fenol:hloroform:izoamilalkohol 25:24:1) i
taloženje u etanolu
Precipitacija DNK cetiltrimetilamonijum
bromidom-CTAB, resuspenzija solima, digestija
RNazom, taloženje etanolom.
Precipitacija DNK na silikatne čestice u
haotropnim solima (guanidintiocijanat-GTC) u
dva formata (u rastvoru i u koloni)
Izolacija helirajućim smolama
Izolacija pomoću paramagnetnih čestica
Elektroforeza u gelu
U zavisnosti od
veličine fragmenata
 U zavisnosti od
potrebne rezolucije

– Agarozna i
poliakrilamidna (i drugi
polimeri)
– Nativna i denaturišuća

Razdvajanje po
veličini i
naelektrisanju
Elektroforeza u gelu
DNK je negativno
naelektrisana
(putuje ka anodi)
 Veći fragmenti
putuju sporije
 Molekularno “sito”

Vizualizacija DNK molekula
Max apsorpcije 260
nm- providna
 DNK-vezujuće boje
(Etidijum bromid,
Cyber Green...)

Vizualizacija DNK molekula
Kapilarna
elektroforeza
 Fluorescentno
obeleženi
fragmenti DNK

Tačkasti polimorfizmi:
SNPs
GC TA T C G
adenine
C GA T AG C
thymin
Single nucleotide polymorphisms
GC TC T C G
guanine
cytosine
C GA G AG C
Sekvenciranje DNK
Maxam
Gillbertova
hemijska
metoda
degradacije
 Sangerova
enzimska
metoda
terminacije
sinteze lanaca

Šta je potrebno za Sangerovu
metodu
Više kopija molekula koji se sekvencira
(klonirani fragment ili PCR produkt)
 Odgovarajući prajmer
 DNK polimeraza (Sekvenaza)
 dNTPs, ddNTPs
 Sistem za razdvajanje DNK fragmenata
 Sistem za detekciju DNK fragmenata

Sekvenciranje molekula DNK Sangerovom metodom
DNK sekvenciranje
Tokom elektroforeze se fragmenti razdvajaju po veličini
Pristupi za sekvenciranje

Manuelno
–
–
–
–

Radioaktivno obeležen prajmer ili dNTPs
Veća vernost
Vrlo sporo
Zahteva puno rada
Automatsko
– Fluorescentno obeležen ddNTP
– Vrlo brzo
– Walk-away procedure
Manuelno sekvenciranje
Nalivanje denaturišućeg (urea)
poliakrilamidnog gela (1 dan)
 Elektroforeza (min 6 sati)
 Ekspozicija 1 dan (phosphoimager
skraćuje)
 Čitanje 300-350 baza (par sati)
 Niža cena

Tipičan izgled
autoradiograma
Automatsko sekvenciranje

Formati:
– Sva 4 nukleotida u isti uzorak
– 1000 baza po uzorku
– 1 do 96 kapilara po mašini
Optimizovani polimeri
(reusable)
 Detekcija fluorescentno
obeleženih nukleotida

Automatski sekvenatori
Intenzitet fluorescencije
(4 različite boje)
Sa grafika fluorescentnih pikova može se pročitati sekvenca molekula
DNK u 5’ to 3’
Vreme
Automatski sekvenatori sa kapilarom
ABI 310
1 kapilara
10 uzorka
10 kBaza dnevno
ABI 3100
16 kapilara
768 uzoraka
845 kbaza dnevno
ABI 3730xl
96 kapilara
4600 uzoraka
5 mega baza dnevno
E.Coli 4Mbp
RT-PCR (qPCR)
RT-PCR (qPCR) nastavak
Drugi DNK polimorfizmi :
STRs
2-7 nuc=STR
Uzastopno ponovljeni nizovi
10-100 nuc=VNTR
OGROMNA VARIJABILNOST!!!!
Kratki uzastopni ponovci
(STRs)
AATG
7 ponovaka
8 ponovaka
Region sa ponovcima je varijabilan a uokvirujući
segmenti su konstantni
Homozigot = Oba alela su iste dužine
Heterozigot = Aleli se razlikuju po dužini
Multiplex PCR




Simultano umnožavanje
većeg broja gena (kraće
vreme)
Osetljivost velika
(manje od 1 ng)(manje
uzorka)
Mogućnost analize mešanih
i degradovanih uzoraka
Različite fluorescentne boje
za razlikovanje STR alela
koji se preklapaju po
veličini
Multiplex PCR
Izgled amplifikovanih
fragmenata
PP16 Promega
TPOX
TPOX
D3S1358
D3S1358
D5S818
D5S818
FGA
CSF1PO
CSF1PO
D8S1179
D8S1179
TH01
TH01
vWA
VWA
D7S820
D7S820
Amel
AMEL
Penta E
Penta D
FGA
D13S317
D13S317
D16S539
D16S539
D18S51
D18S51
D21S11
D21S11
Amel
AMEL