Transcript Document

Prošla nedelja
Imunoaglutinacija (princip, podela, primena)
Imunoprecipitacija (princip, podela, primena)
ANTIGEN-ANTITELO
REAKCIJE SA OBELEŽENIM
ANTITELIMA
ANTIGEN-ANTITELO REAKCIJE
SA OBELEŽENIM ANTITELIMA
M
At
M - marker
Fc
Fab
Fab
ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY
IMUNOFLUORESCENCIJA
RADIOIMMUNO ASSAY
(ELISA,EIA) - marker ENZIM
(IF) - marker FLUORESCENTNA BOJA
(RIA) - marker RADIOAKTIVNI IZOTOP
Enzimski imuno-test
(EIA, ELISA)
Koristi se za detekciju antigena u tečnim uzorcima (npr. serumu) ili
antitela (najčešće u serumu)
Marker je enzim, a obeleženo je primarno At (specifično za antigen) ili
sekundarno At (anti-Ig antitelo)
Bazira se na principu promene boje supstrata pod dejstvom enzima
Signal se detektuje kolorimetrijski (pomoću spektrofotometra)
Može da bude kvalitativna ili kvantitativna
Obavlja se u pločama za mikrotitraciju (pločama sa 96 rupica)
ELISA detekcija antitela
ispitivani serum
antigen kojim je
obložena ploča
ELISA detekcija antitela
12
6
Ispiranje
Inkubacija
ELISA detekcija antitela
E
E
E
E
obeležena
sekundarna At
ELISA detekcija antitela
12
E
6
E
E
E
Inkubacija
ELISA detekcija antitela
E
E
E
E
Ispiranje
12
ELISA detekcija antitela
6
E
E
E
Kolorimetrijska detekcija
ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)
Ag
uzorak
(serum)
neobeležena
Ag-specifična
At
ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)
12
6
Ispiranje
Inkubacija
ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)
12
E
6
E
obeležena
Ag-specifična
At
E
E
E
Ispiranje
Inkubacija
ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)
12
6
dodavanje
supstrata
E
E
Kolorimetrijska detekcija
Imunofluorescencija
(IF)
Koristi se za detekciju antigena (na ili u ćeliji/tkivu) ili antitela
(najčešće u serumu)
Marker je fluorescentna boja (fluorohrom), a obeleženo je
primarno At (specifično za antigen) ili sekundarno At (anti-Ig antitelo)
Bazira se na principu da fluorohromi kada se ozrače svetlom jedne
talasne dužine bivaju pobuđeni da emituju svetlo druge talasne dužine
(fluorescein – zeleno, rodamin – crveno ...)
Signal se detektuje pomoću fluorescentnog mikroskopa ili
protočnog citoflourimetra
Detekcija Ag
DIREKTNA (DIF)
(obeleženo primarno At)
IMUNOFLUORESCENCIJA
INDIREKTNA (IIF)
(obeleženo sekundarno At)
DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
F
F
fiksirani
uzorak
F
F
obeležena
primarna At
DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
12
F
6
F
F
Ispiranje
Inkubacija
F
DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
Ekscitacija
F
F
Fluorescencija
DIF Chlamydia trachomatis
Detekcija Ag
DIREKTNA (DIF)
(obeleženo primarno At)
IMUNOFLUORESCENCIJA
Detekcija Ag
INDIREKTNA (IIF)
(obeleženo sekundarno At)
Detekcija At
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija i kvantitiranje At u serumu pacijenta)
ispitivani serum
fiksirani
antigen
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija At u serumu pacijenta)
6
Ispiranje
Inkubacija
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija At u serumu pacijenta)
F
F
F
F
Inkubacija
obeleženo
sekundarno At
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija At u serumu pacijenta)
12
F
6
F
F
F
Inkubacija
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija At u serumu pacijenta)
F
F
F
F
Ispiranje
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija At u serumu pacijenta)
F
F
Ekscitacija
Fluorescencija
F
Indirektna
Imunofluorescencija
ANCA (anti neutrofilna At protiv citoplazmatskih Ag)
Neutrofili (cANCA)
Citoplazmatsko vezivanje
Neutrofili (pANCA)
Perinuklearno vezivanje
Indirektna
Imunofluorescencija
(At protiv Ag glomerularne bazalne membrane)
Glomerulonefritis Goodpasture’s sindrom
Detekcija Ag
DIREKTNA (DIF)
specifičnost
(obeleženo primarno At)
IMUNOFLUORESCENCIJA
Detekcija Ag
INDIREKTNA (IIF)
(obeleženo sekundarno At)
osetljivost
Detekcija At
Radio-imunotest (RIA)
Nobelova nagrada za
fiziologiju ili medicinu 1977
"for the development of radioimmunoassays of
peptide hormones"
Rosalyn Sussman Yalow
July 19, 1921 – May 30, 2011
Vrlo osetljiv kvantitativan test
Koristi se za određivanje niskih koncentracija antigena u rastvoru
(npr. hormona u krvi)
Marker je radioaktivni izotop (npr.
125I)
Meri se vezana radioaktivnost pomoću odgovarajućeg brojača
Nedostatak: rad sa radioaktivnošću i odlaganje radioaktivnog otpada
Brzi test za otkrivanje
trudnoće
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE
(princip)
Detekcija HCG u urinu trudne žene
Koriste se tri vrste antitela:
1. anti-HCG antitelo - obeleženo koloidnim zlatom (slobodno)
2. anti-HCG antitelo – neobeleženo (fiksirano za membranu)
3. anti-imunoglobulinsko antitelo – neobeleženo (fiksirano za
membranu)
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE
(rezultati)
+
uzorak (urin)
pozitivan
–
uzorak (urin)
negativan
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE
(pozitivan rezultat)
uzorak
(urin)
pozitivan
uzorak
(urin)
neobeleženo
anti-HCG
At
HCG
obeleženo
anti-HCG
At
difuzija
Z
Z
Z
Z
anti-Ig
At
difuzija
+
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE
(negativan rezultat)
negativan
uzorak
(urin)
uzorak
(urin)
neobeleženo
anti-HCG
At
difuzija
obeleženo
anti-HCG
At
Z
Z
Z
Z
anti-Ig
At
difuzija
–
1. ELISA se koristi za detekciju
a. enzimom
2. Antitelo u ELISA testu obeleženo je
b. kolorimetrom
3. ELISA se radi
c. antigena ili antitela u tečnim uzorcima
4. Razgrađeni supstrat od strane enzima u d. indirektna
ELISA testu detektuje se
ELISA
imunofluorescenca
ili
5. U ELISA testu količina antigena ili e. jačine boje razgrađenog supstrata
antitela određuje se na osnovu
6. U testu indirektne imunofluorescencije
fluorescentnom bojom je obeleženo
f. radioaktivni izotop
7. Za dokazivanje bakterije iz roda g. u ploči za mikrotitraciju
Chlamydia u cervikalnom brisu koristi se
8. Za dokazivanje auto-antitela u serumu h. RIA i ELISA
koristi se
9. U RIA testu se kao obeleživač koristi
10. Za određivanje količine hormona u krvi
koristi se
i. direktna imunofluorescencija
j. anti-imunoglobulinsko antitelo
c
a
g
b
e
j
i
d
f
h
1.____
2.____
3.____
4.____
5.____
6.____
7.____
8.____
9.____
10.____
Sledeća nedelja
Predavanje:
Imunološka tolerancija: značaj i mehanizmi
Autoimunost: principi i patogeneza
Seminar:
Reakcije preosetljivosti