Transcript ANTIGEN-ANTITELO REAKCIJE

ANTIGEN-ANTITELO
REAKCIJE
Plan
• Ag-At reakcije (opšte osobine)
• Imunoaglutinacija
• Imunoprecipitacija
• Ag-At reakcije sa obeleženim reagensima
• Ag-At reakcije zavisne od komplementa
Ag-At reakcije su laboratorijske reakcije između antigena i
odgovarajućih specifičnih antitela
Ispituje se prisustvo ili antigena (korišćenjem poznatog antitela) ili
antitela (korišćenjem poznatog antigena) u uzorku (npr. serumu)
Tradicionalno se zovu i serološke reakcije
Mogu da budu:
1. Kvalitativne
Rezultat:
POZITIVAN
NEGATIVAN
2. Kvantitativne
Ag - KONCENTRACIJA (npr. 2 mg/ml)
At - TITAR (npr. 1/80)
TITAR je mera količine specifičnih antitela i predstavlja vrednost
(recipročnu) najvećeg razblaženja seruma koji daje pozitivnu reakciju
IMUNOAGLUTINACIJA
IMUNOAGLUTINACIJA je reakcija između korpuskularnog
(nerastvorljivog) antigena i odgovarajućih specifičnih antitela
Antigen je najčešće na površini ćelije (npr. bakterije) ili je
solubilan molekul vezan za inertnu nesolubilnu česticu (nosač)
Rezultat reakcije je aglutinat, vidljiva struktura nastala
zgomilavanjem tj. aglutinacijom čestica
Optimalno stvaranje aglutinata javlja se u zoni ostvarivanja
ekvivalentnog odnosa između antitela i antigena
EKVIVALENTAN
(OPTIMALAN)
ODNOS
VIŠAK ANTIGENA
MALI
VELIKI
MALI
NE POSTOJI
POSTOJI
NE POSTOJI
NEPOUZDAN
(LAŽNO NEGATIVAN)
FENOMEN PROZONE
POUZDAN
(POZITIVAN)
NEPOUZDAN
(LAŽNO NEGATIVAN)
VIŠAK ANTITELA
Ag-At KOMPLEKSI:
AGLUTINACIJA:
REZULTAT:
Primena (Primer)
Detekcija Ag
DIREKTNA
Krajnja identifikacija
bakterija
(enterobakterije)
Detekcija At
BAB test
(brucele)
IMUNOAGLUTINACIJA
Detekcija At
(Ag vezan za nosač)
INDIREKTNA
(pasivna)
Detekcija Ag
(At vezano za nosač)
Lateks RF test
(reumatoidni
faktor)
HBsAg test
(hepatitis B virus)
IMUNOPRECIPITACIJA
IMUNOPRECIPITACIJA je reakcija između solubilnog
(rastvorljivog) antigena i odgovarajućih specifičnih antitela
Antigen je najčešće neki produkt mikroorganizma (npr. toksin) ili
protein plazme i drugih telesnih tečnosti (imunoglobulini, komponente
komlementa itd.)
Rezultat reakcije je precipitat (talog), tj. dolazi do izdvajanja
antigen-antitelo komkpleksa u vidu taloga
Do formiranja precipitata dolazi u zoni ostvarivanja ekvivalentnog
(optimalnog) odnosa koncentracija antitela i antigena
Metodi imunoprecipitacije mogu da se odigravaju u:
tečnoj sredini
slobodnom difuzijom (talog se formira posle nekoliko minuta)
polučvrstoj sredini (gelu)
slobodnom difuzijom (talog se formira posle više dana)
pomoću električne struje (talog se formira posle nekoliko sati)
PRIMER
RING test
(Kvalitativna)
Askolijeva reakcija
(antraks)
U TEČNOJ SREDINI
Nefelometrija
(Kvantitativna)
IMUNOPRECIPITACIJA
određivanje
koncentracije
proteina u serumu
(Ig, komponente C‛)
Dvostruka
imunodifuzija
Elekova proba
RID test
određivanje
koncentracije
proteina u serumu
(Ig, komponente C‛)
(Kvalitativna)
U POLUČVRSTOJ SREDINI
(GELU)
(Kvantitativna)
(difterija)
Interfacijalni (interfazni) test prstena – RING test
(princip)
Nefelometrija
(princip)
Dvostruka imunodifuzija u gelu – Elekova proba
(princip)
Jednostruka radijalna imunodifuzija – RID test
(princip)
At u gelu
2
3
4
Ag u rupice:
1
1
standard poznate koncentracije
RID
2
standard poznate koncentracije
IgG
3
standard poznate koncentracije
4
uzorak pacijenta
5
uzorak pacijenta
5
Jednostruka radijalna imunodifuzija – RID test
(princip)
D2 (mm2)
3
2
1
4
5
Ag – koncentracija (g/l)
ANTIGEN-ANTITELO
REAKCIJE SA OBELEŽENIM
REAGENSIMA
ANTIGEN-ANTITELO REAKCIJE
SA OBELEŽENIM ANTITELIMA
M
At
M - marker
Fc
Fab
Fab
ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY
IMUNOFLUORESCENCIJA
RADIOIMMUNO ASSAY
(ELISA) - marker ENZIM
(IF) - marker FLUORESCENTNA BOJA
(RIA) - marker RADIOAKTIVNI IZOTOP
Enzimski imuno-test
(ELISA)
Koristi se za detekciju antigena u tečnim uzorcima (npr. serumu) ili
antitela (tipično u serumu)
Marker je enzim, a obeleženo je primarno At (specifično za antigen) ili
sekundarno At (anti-Ig antitelo)
Bazira se na principu promene boje supstrata pod dejstvom enzima
Signal se detektuje kolorimetrijski (pomoću spektrofotometra)
Može da bude kvalitativna ili kvantitativna
Obavlja se u pločama za mikrotitraciju (pločama sa 96 rupica)
ELISA
(ploča sa pozitivnim uzorcima – primer 1)
ELISA
(ploča sa pozitivnim uzorcima – primer 2)
ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)
Ag
uzorak
(serum)
neobeležena
Ag-specifična
At
ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)
12
6
Ispiranje
Inkubacija
ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)
12
E
6
E
obeležena
Ag-specifična
At
E
E
E
Ispiranje
Inkubacija
ELISA (detekcija Ag u tečnom uzorku - SANDWICH ELISA)
12
6
dodavanje
supstrata
E
E
Kolorimetrijska detekcija
ELISA detekcija antitela
(detekcija At u serumu pacijenta)
Ispitivani serum
Antigen kojim je
obložena ploča
12
ELISA detekcija antitela
(detekcija At u serumu pacijenta)
6
Ispiranje
Inkubacija
ELISA detekcija antitela
(detekcija At u serumu pacijenta)
E
E
E
E
Obeležena
Ig-specifična At
ELISA detekcija antitela
(detekcija At u serumu pacijenta)
12
E
6
E
E
E
Inkubacija
ELISA detekcija antitela
(detekcija At u serumu pacijenta)
E
E
E
E
Ispiranje
12
ELISA detekcija antitela
(detekcija At u serumu pacijenta)
6
E
E
E
Kolorimetrijska detekcija
Imunofluorescencija
(IF)
Koristi se za detekciju antigena u čvrstim uzorcima (npr. na ili u
ćeliji/tkivu) ili antitela (tipično u serumu)
Marker je fluorescentna boja (fluorohrom), a obeleženo je
primarno At (specifično za antigen) ili sekundarno At (anti-Ig antitelo)
Bazira se na principu emitovanja boje pod dejstvom UV svetla
Signal se detektuje pomoću fluorescentnog mikroskopa
Može da bude samo kvalitativna i eventualno semi-kvantitativna
Obavlja se obično na mikroskopskim pločicama
Detekcija Ag u/na ćelijama i tkivima
DIREKTNA (DIF)
specifičnost
(obeleženo primarno At)
IMUNOFLUORESCENCIJA
Detekcija Ag u/na ćelijama i tkivima
INDIREKTNA (IIF)
(obeleženo sekundarno At)
osetljivost
Detekcija At u serumu
Imunofluorescencija
(primer 1)
Helicobacter pylori
Borrelia burgdorferi
Imunofluorescencija
(primer 2)
Neutrofili
Imunofluorescencija
(primer 3)
Glomerulonefritis
DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija Ag u čvrstom uzorku)
F
F
fiksirani
uzorak
F
F
obeležena
Ag-specifična
At
12
DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija Ag u čvrstom uzorku)
F
6
F
F
Ispiranje
Inkubacija
F
DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija Ag u čvrstom uzorku)
Ekscitacija
F
F
Fluorescencija
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija Ag u čvrstom uzorku)
neobeležena
Ag-specifična
At
fiksirani
uzorak
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija Ag u čvrstom uzorku)
6
Ispiranje
Inkubacija
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija Ag u čvrstom uzorku)
F
F
F
F
Inkubacija
Obeležena
Ig-specifična At
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija Ag u čvrstom uzorku)
12
F
6
F
F
F
Inkubacija
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija Ag u čvrstom uzorku)
F
F
F
F
Ispiranje
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija Ag u čvrstom uzorku)
F
Ekscitacija
Fluorescencija
F
F
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija At u serumu pacijenta)
Ispitivani serum
fiksirani
antigen
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija At u serumu pacijenta)
6
Ispiranje
Inkubacija
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija At u serumu pacijenta)
F
F
F
F
Inkubacija
Obeležena
Ig-specifična At
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija At u serumu pacijenta)
12
F
6
F
F
F
Inkubacija
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija At u serumu pacijenta)
F
F
F
F
Ispiranje
INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA
(detekcija At u serumu pacijenta)
F
Ekscitacija
Fluorescencija
F
F
Radio-imunotest
(RIA)
Koristi se za detekciju antigena u tečnim uzorcima (npr. serumu) ili
antitela (tipično u serumu)
Marker je radioaktivni izotop (npr.
antitelo
125I),
a obeležen je ili antigen ili
Bazira se na principu radioaktivnosti
Signal se detektuje pomoću brojača (broj raspada)
Vrlo osetljiv kvantitativan test
Problem zbog rada sa radioaktivnošću i odlaganja otpada
Antigen-antitelo reakcije
zavisne od komplementa
Ag-At reakcija in vitro koje postaju detektabilne
(merljive) usled aktivacije prisutnog komplementa
Koriste se za:
1. Funkcionalno ispitivanje komplementa
Test titracije komplementa
2. Detekciju antigena ili antitela
Reakcija vezivanja komplementa (RVK)
Mikrocitotoksični test (HLA tipizacija)
Test titracije komplementa
(Funkcionalno ispitivanje komplementa)
Postupak za određivanje ukupne hemolizne aktivnosti C‛
Zasniva se na lizi senzibilisanih eritrocita (eritrocita obloženih
anti-eritrocitnim antitelima) u toku aktivacije klasičnog puta
Izražava se u:
CH50 jedinicama u ml (spektrofotometrijski na osnovu optičke
gustine oslobođenog hemoglobina)
CH100 jedinicama u ml (golim okom)
Reakcija vezivanja komplementa
(Test fiksacije komplementa)
Postupak za određivanje specifičnih antitela (npr. za respiratorne
viruse) u serumu pacijenata
Zasniva se na lizi senzibilisanih eritrocita (eritrocita obloženih
anti-eritrocitnim antitelima) usled aktivacije komplementa
nastalim Ag-At kompleksima
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter31/animation_quiz_4.html
Reakcija
vezivanja
Komplementa
(princip)
Liza eritrocita
Serum
Odsustvo lize
eritrocita
(eritrocitno
dugme)
Antigen
Antigen
vezan
Antigen
slobodan
Komplement
vezan
(aktiviran)
Komplement
slobodan
(neaktiviran)
Nema
komplementa
Komplement
aktiviran
Nema lize Er
Taloženje Er
Liza Er
+
+
Senzibilisani Er
(indikator)
=
Rezultat
pozitivan
Serum bez
antitela
+
Komplement
negativan
Serum sa
antitelima
Pozitivan
Negativan
Brzi test za otkrivanje
trudnoće
(demonstracija)
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE
(princip)
detekcija beta HCG u urinu trudne žene
koriste se tri vrste antitela:
1. anti-HCG antitelo - obeleženo koloidnim zlatom (slobodno)
2. anti-HCG antitelo – neobeleženo (fiksirano za membranu)
3. anti-imunoglobulinsko antitelo – neobeleženo (fiksirano za
membranu)
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE
(rezultati)
+
uzorak (urin)
pozitivan
–
uzorak (urin)
negativan
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE
(pozitivan rezultat)
uzorak
(urin)
pozitivan
uzorak
(urin)
neobeleženo
anti-HCG
At
HCG
obeleženo
anti-HCG
At
difuzija
Z
Z
Z
Z
anti-Ig
At
difuzija
+
BRZI TEST ZA OTKRIVANJE TRUDNOĆE
(negativan rezultat)
negativan
uzorak
(urin)
uzorak
(urin)
neobeleženo
anti-HCG
At
difuzija
obeleženo
anti-HCG
At
Z
Z
Z
anti-Ig
At
difuzija
Z
http://bio-alive.com/animations/immunology.htm
–