predavanje 3
Download
Report
Transcript predavanje 3
Solubilni produkti imunskog
odgovora kao biomarkeri
Dijagnostička imunologija
Razdvojiti senzitivnost od specifičnosti u
dijagnostičkim testovima
•
Senzitivnost: verovatnoća da će test pokazati
reakciju ako je uzorak zaista pozitivan
•
Specifičnost: verovatnoća da pozitivan test neće biti
reaktivan ako je uzorak zaista negativan
•
Koja karakteristika je korisnija za pomoć u dijagnozi
bolesti: specifičnost ili senzitivnost?
Testovi zasnovani na Ag/At reakciji
Antigen-antitelo (Ag-At) reakcije čine osnovu mnogih in vitro metoda
koje se obavljaju u laboratorijskim uslovima u dijagnostičke svrhe.
Ispituje se prisustvo antigena ili antitela u odgovarajućem uzorku
(serumu, likvoru, sinovijalnoj tečnosti...).
- infektivni agens ili njegov deo (npr. HbsAg, p24 HIV...)
- drugi molekuli (npr. citokini, hormoni, komponente
komplementa, tumor markeri, proteini akutne faze , Ig...)
- ukupni Ig (pojedine klase) ili specifična At za određeni Ag
Tradicionalno se zovu i
serološke reakcije/testovi
Serološki testovi
• Direktni testovi
za detekciju Ag ili At (uzorak pacijenta)
• Indirektni testovi
za detekciju At ili Ag (u serumu pacijenta)
Dokazivanje krvnih grupa
kap krvi
+
+
+
antitelo
1
2
ishod
Direktna
aglutinacija
3
4
Određivanje reumatoidnog faktora (anti-IgG At)
Rose Waalerov test
Indirektna aglutinacija
Stari test- ovčiji Er obloženi subaglutinišućom
količinom kunićevog IgG antitela specifičnog za
ovčije Er; kada se ovakvi Er izlože dejstvu humanog
seruma koji sadrži RF dolazi do aglutinacije
Test lateks aglutinacije
na čestice lateksa se vežu molekuli humanih IgG i
posmatra se aglutinacija čestica posle dodatka
seruma ispitanika)
A pozitivan test
(aglutinacija lateks
čestica)
B-E negativan test (nema
aglutinacije lateks
čestica)
Coombsov test
Antiimunoglobulinski test
Coombsov test
Direktni Coombsov test
Indirektni Coombsov test
Služi za određivanje autoantitela
specifičnih za sopstvene eritrocite
Detektuje neaglutinirajuća anti-Rh
antitela klase IgG u serumu Rhtrudnica
Koristi se u transfuziji za
predviđanje transfuzionih reakcija
Normalan nalaz - nema aglutinacije
Pozitivan nalaz – aglutinacija
1. Autoimunske hemolitičke anemije
2. Hemolitičke anemije izazvane
lekovima
3. Autoimunske bolesti
4. Infektivna mononukleoza
Serum se inkubira sa Rh+
eritrocitima koji vežu anti-Rh
antitela, zatim se dodaju zečija,
antiglobulinska antihumana antitela
Pozitivan test - Rh inkompatibilnost
(hemolitička bolest novorođenčeta)
Reakcija inhibicije aglutinacije
Klinički se primenjuje za:
• dokazivanje infekcije virusom influence
• Hemaglutinacija uključuje aglutinaciju Er, a neki virusi aglutiniraju
Er in vitro. Antitela iz ispitivanog seruma inhibiraju hemaglutinaciju.
Reakcija inhibicije aglutinacije
Klinički se primenjuje za:
• dokazivanje trudnoće - HCG u urinu
Test fiksacije komplementa
I faza
Test fiksacije komplementa
II faza
Elektroforeza
Elektroforeza proteina predstavlja opšte prihvaćenu metodu
za detekciju i kvantifikaciju pojedinih klasa proteina koji u
nekim bolestima mogu biti značajno povišeni (npr. u toku nekih
infekcija ili nekih monoklonskih hiper γ globulinemija)
Kombinovana sa određivanjem ukupne količine proteina u
serumu ova metoda je neophodna u dijagnostici i terapeutskom
praćenju mnogih akutnih bolesti, posebno malignih monoklonskih
gamopatija i imunodeficijencija.
Zonska elektroforeza
celuloza-acetat, agar i agaroza (ne ometaju protok molekula)
razdvajanje proteina na osnovu površinskog naboja
uzorci seruma se stave u početni položaj, nakon čega se propušta
jednosmerna struja (90 min)
da bi se obezbedio protok struje, upotrebljava se odgovarajući pufer
sa određenim pH i odgovarajućom jonskom jačinom
glavni proteini seruma putuju ka anodi; po završteku elektroforeze
trake se detektuju bojama za proteine, a intenzitet boje se meri u
denzitometru
Zonska elektroforeza
proteini normalnog seruma se elektroforezom razdvajaju u 5
glavnih zona/traka:
1.
2.
3.
4.
5.
Albumin
α1-globulin (α1 antitripsin)
α2-globulin (haptoglobin i α2 mikroglobulin)
β-globulin (transferin i komponente komplementa)
γ-globulin (imunoglobulini)
Primeri poremećaja detektovanih zonskom elektroforezom
+
akutna inflamacija
Alfa-1 i alfa-2 trake su povećane
tokom inflamatornog odogovora zbog
povećane sinteze akutno faznih
reakatanata od strane hepatocita
-
+
ciroza jetre
koncentracija
albumina
i
proteina alfa i beta traka je
smanjena
+
+
-
hronična inflamacija
Sinteza Ig od strane antigenom
aktiviranih B Ly transformisanih u
plazma ćelije se detektuje
povećanjem poliklonskih gama traka
-
hipogamaglobulinemija
Deficit sinteze Ig se ogleda kroz značajno smanjenje gama
trake. Osobe sa ovim defektom imaju rekurentne infekcije
Imunoelektroforeza
Zonska elektroforeza ništa ne govori o strukturnim osobinama pojedinih
proteina koji su u povećanim koncentracijama pa se iz tih razloga mora
dopuniti sličnom analizom koju nazivamo imunoelektroforeza
Imunoelektroforeza predstavlja kombinaciju
elektroforeze
serumskih
proteina
sa
imunoprecipitacijskom detekcijom
Elektroforezom se obezbeđuje separacija
serumskih proteina
Imunoprecipitacijom se detektuju pojedine
imunoglobulinske klase i
drugi specifični
proteini u serumu
Dve su srodne metode:
Imunoelektroforeza (IEF)
Imunofiksaciona elektroforeza (IFE)
Imunoelektroforeza
IEF je pouzdan i tačan metod za
detekciju strukturnih
abnormalnosti i poremećaja u
koncentraciji proteina.
Najčešće se primenjuje u
dijagnozi monoklonskih
gamopatija
Najvažnija primena u ispitivanju
urina je dokazivanje Bence Jones
proteina (kapa ili lambda laki
lanci)
Imunoelektroforeza
Imunoelektroforeza je metoda kojom se pojedine komponente seruma mogu
razlikovati ne samo na osnovu njihove pokretljivosti u električnom polju, već i na
osnovu njihove antigenosti.
Izvodi se u dve faze.
Prva faza je po načinu izvođenja identična zonskoj elektroforezi. U agaru se
naprave se rupice dijametra do 2 mm u koje se stavlja serum ispitivanih osoba.
Zatim se propusti struja u određenom vrmenskom intervalu. Time se vrši
razdvajanje seruma na komponente.
U drugoj fazi se stavlja antiserum odgovarajuće specifičnosti u napravljeni
uzdužni kanal širine do 2 mm: antihumani IgG, IgA, IgM itd. Anti serum posle
određenog vremena difunduje i u područjima ekvivalencije stvara precipitate.
Pošto komponente seruma difunduju radijalno a antiserum u jednom smeru,
pericipitati imaju lučni izgled.
Imunoelektroforeza je isključivo kvalitativna metoda i omogućava samo
razlikovanje pojedinih sastojaka seruma (negde oko 30), a takođe se tom
metodom otkriva prisustvo tzv. patoloških imunoglobulina
21
precipitacija
Uzorak serum
pacijenta
+
anti humani serum
imunodifuzija
Struja
Zonska
elektroforeza
precipitacija
Imunoelektroforeza humanog seruma u agaru
(natrijum barbituratni pufer pH-8,2)
Protein
Koncentracija (g/l)
Albumin
47,6
a1 globulin
6,1
a2 -globulin
12,3
b - globulin
12,2
g-globulin
53,6
Imunoelektroforeza
Interpretacija nalaza
1. Reakcija proteina (antigena) sa antitelom
"ima/nema„ - dokazuje se prisustvo ili odsustvo proteina u
mešavini antigena
2. Promene u elektroforetskoj mobilnosti
"normalna/izmenjena"
promene u primarnoj strukturi ili
fragmentacija proteina, pri čemu
fragmenti imaju izmenjenu brzinu
u odnosu na nativni protein
Imunoelektroforeza
3. Promene u distanci preciptiranih lukova
"normalna/izmenjena"
Smanjeno rastojanje od kanala:
• povećana konc. ili prisustvo
proteina manje Mr (ubrzana
difuzija)
Povećano rastojanje od kanala:
• smanjena konc. ili prisustvo
agregata (usporena
difuzija)
4. Promene u obliku i izgledu luka
Monoklonski imunoglobulini u
monoklonskim gamapatijama
Imunoelektroforeza
LABORATORIJSKO ODREĐIVANJE AUTOANTITELA
Određivanje autoantitela je:
* kvalitativno
* kvantitativno: * titar
* arbitrarne jedinice
* koncentracija (standard)
Bazirano na imunohemijskoj detekciji:
* aglutinacija
* precipitacija
* ELISA
* turbidimetrija
* imunobloting
* imunofluorescenca
IMUNOFLUORESCENTNO ODREĐIVANJE AUTOANTITELA
detekcija autoantitela koja reaguju sa
tkivnim (intracelularnim) antigenima
Upotreba :
* tkivnih preseka (organ-specifična autoantitela)
* ćelijske suspenzije: * Hep-2 ćelijska linija (ANA)
* granulociti (ANCA)
Indirektna imunofluorescenca
ANCA-Wegener-ova granulamatoza
Antitela specifična za ACH receptor (Miastenija gravis)
ANA – sistemske reumatske bolesti (SLE, polimozitis,
skleroderma, Sjogren-ov sindrom), rekcije na lekove,
hronične infekcije, RA i druge autoimunske bolesti
Anti-fosfolipidna antitela – anti-fosfolipidni sindrom
RF (IgM, IgA ili IgG) – reumatoidni artritis
ANCA ANTITELA
ANCA=
autoantitela specifična za citoplazmatske Ag neutrofila
* Substrat su etanolom fiksirani humani granulociti
* prisutna u naglašenim tipovima vaskulitisa
Indirektna imunofluorescencija
ANCA (At specifična za citoplazmatske Ag neutrofila)
Neutrofili (cANCA)
Citoplazmatsko vezivanje
Neutrofili (pANCA)
Perinuklearno vezivanje
ANCA AUTOANTITELA I VASKULITISI
Antigen - proteinaza-3
u primarni granulama
Wegener
granulomatoza
Antigen –
mijeloperoksidaza
Cistična
fibroza (90%),
Hronični
hepatitis (80%),
SLE, RA
Indirektna imunofluorescencija
(At specifična za Ag bazalne membrane glomerula bubrega)
Glomerulonefritis Goodpasture’s sindrom
IMUNOFLUORESCENTNO ODREĐIVANJE
ANTI-NUKLEARNIH AUTOANTITELA (ANA)
* autoantitela reaguju sa jedarni
mitotički
aparat
aparatom
centromera
ANA
* prisutna kod pacijenata sa
sistemskim bolestima vezivnog tkiva
* njihov nivo je povezan sa
intezitetom inflamacije
ENA:
ekstraktabilni nuklearni antigeni
Imunofluorescentno bojenje
anti-nuklearna antitela - ANA
oblik bojenja antigen
periferno
dsDNK
Imunofluorescentno bojenje
anti-nuklearna antitela - ANA
oblik bojenja antigen
periferno
dsDNK
homogeno
difuzno
histoni
Imunofluorescentno bojenje
anti-nuklearna antitela - ANA
oblik bojenja antigen
periferno
dsDNK
homogeno
difuzno
histoni
nukleolarno RNK
nukleolusa
Imunofluorescentno bojenje
anti-nuklearna antitela - ANA
oblik bojenja antigen
periferno
dsDNK
homogeno
difuzno
histoni
nukleolarno RNK
nukleolusa
mrljasto
ENA (ekstraktabilni nuklearni antigeni)
Sm, RNP, SS-A(Ro), SS-B (La), Jo-1, Scl-70
CENTROMERNA FLUORESCENCA
Ag: kinetohore hromozoma,
centromerni Ag (CENPA,B,C,D,E)
dsDNA
(nativna DNK)
Ag: nativna dsDNK