Transcript predavanje 3

Solubilni produkti imunskog
odgovora kao biomarkeri
Dijagnostička imunologija
Razdvojiti senzitivnost od specifičnosti u
dijagnostičkim testovima
•
Senzitivnost: verovatnoća da će test pokazati
reakciju ako je uzorak zaista pozitivan
•
Specifičnost: verovatnoća da pozitivan test neće biti
reaktivan ako je uzorak zaista negativan
•
Koja karakteristika je korisnija za pomoć u dijagnozi
bolesti: specifičnost ili senzitivnost?
Testovi zasnovani na Ag/At reakciji
Antigen-antitelo (Ag-At) reakcije čine osnovu mnogih in vitro metoda
koje se obavljaju u laboratorijskim uslovima u dijagnostičke svrhe.
Ispituje se prisustvo antigena ili antitela u odgovarajućem uzorku
(serumu, likvoru, sinovijalnoj tečnosti...).
- infektivni agens ili njegov deo (npr. HbsAg, p24 HIV...)
- drugi molekuli (npr. citokini, hormoni, komponente
komplementa, tumor markeri, proteini akutne faze , Ig...)
- ukupni Ig (pojedine klase) ili specifična At za određeni Ag
Tradicionalno se zovu i
serološke reakcije/testovi
Serološki testovi
• Direktni testovi
za detekciju Ag ili At (uzorak pacijenta)
• Indirektni testovi
za detekciju At ili Ag (u serumu pacijenta)
Dokazivanje krvnih grupa
kap krvi
+
+
+
antitelo
1
2
ishod
Direktna
aglutinacija
3
4
Određivanje reumatoidnog faktora (anti-IgG At)
 Rose Waalerov test
Indirektna aglutinacija
Stari test- ovčiji Er obloženi subaglutinišućom
količinom kunićevog IgG antitela specifičnog za
ovčije Er; kada se ovakvi Er izlože dejstvu humanog
seruma koji sadrži RF dolazi do aglutinacije
 Test lateks aglutinacije
na čestice lateksa se vežu molekuli humanih IgG i
posmatra se aglutinacija čestica posle dodatka
seruma ispitanika)
A pozitivan test
(aglutinacija lateks
čestica)
B-E negativan test (nema
aglutinacije lateks
čestica)
Coombsov test
Antiimunoglobulinski test
Coombsov test
Direktni Coombsov test
Indirektni Coombsov test
Služi za određivanje autoantitela
specifičnih za sopstvene eritrocite
Detektuje neaglutinirajuća anti-Rh
antitela klase IgG u serumu Rhtrudnica
Koristi se u transfuziji za
predviđanje transfuzionih reakcija
Normalan nalaz - nema aglutinacije
Pozitivan nalaz – aglutinacija
1. Autoimunske hemolitičke anemije
2. Hemolitičke anemije izazvane
lekovima
3. Autoimunske bolesti
4. Infektivna mononukleoza
Serum se inkubira sa Rh+
eritrocitima koji vežu anti-Rh
antitela, zatim se dodaju zečija,
antiglobulinska antihumana antitela
Pozitivan test - Rh inkompatibilnost
(hemolitička bolest novorođenčeta)
Reakcija inhibicije aglutinacije
Klinički se primenjuje za:
• dokazivanje infekcije virusom influence
• Hemaglutinacija uključuje aglutinaciju Er, a neki virusi aglutiniraju
Er in vitro. Antitela iz ispitivanog seruma inhibiraju hemaglutinaciju.
Reakcija inhibicije aglutinacije
Klinički se primenjuje za:
• dokazivanje trudnoće - HCG u urinu
Test fiksacije komplementa
I faza
Test fiksacije komplementa
II faza
Elektroforeza
 Elektroforeza proteina predstavlja opšte prihvaćenu metodu
za detekciju i kvantifikaciju pojedinih klasa proteina koji u
nekim bolestima mogu biti značajno povišeni (npr. u toku nekih
infekcija ili nekih monoklonskih hiper γ globulinemija)
 Kombinovana sa određivanjem ukupne količine proteina u
serumu ova metoda je neophodna u dijagnostici i terapeutskom
praćenju mnogih akutnih bolesti, posebno malignih monoklonskih
gamopatija i imunodeficijencija.
Zonska elektroforeza
 celuloza-acetat, agar i agaroza (ne ometaju protok molekula)
 razdvajanje proteina na osnovu površinskog naboja
 uzorci seruma se stave u početni položaj, nakon čega se propušta
jednosmerna struja (90 min)
 da bi se obezbedio protok struje, upotrebljava se odgovarajući pufer
sa određenim pH i odgovarajućom jonskom jačinom
 glavni proteini seruma putuju ka anodi; po završteku elektroforeze
trake se detektuju bojama za proteine, a intenzitet boje se meri u
denzitometru
Zonska elektroforeza
 proteini normalnog seruma se elektroforezom razdvajaju u 5
glavnih zona/traka:
1.
2.
3.
4.
5.
Albumin
α1-globulin (α1 antitripsin)
α2-globulin (haptoglobin i α2 mikroglobulin)
β-globulin (transferin i komponente komplementa)
γ-globulin (imunoglobulini)
Primeri poremećaja detektovanih zonskom elektroforezom
+
akutna inflamacija
Alfa-1 i alfa-2 trake su povećane
tokom inflamatornog odogovora zbog
povećane sinteze akutno faznih
reakatanata od strane hepatocita
-
+
ciroza jetre
koncentracija
albumina
i
proteina alfa i beta traka je
smanjena
+
+
-
hronična inflamacija
Sinteza Ig od strane antigenom
aktiviranih B Ly transformisanih u
plazma ćelije se detektuje
povećanjem poliklonskih gama traka
-
hipogamaglobulinemija
Deficit sinteze Ig se ogleda kroz značajno smanjenje gama
trake. Osobe sa ovim defektom imaju rekurentne infekcije
Imunoelektroforeza
 Zonska elektroforeza ništa ne govori o strukturnim osobinama pojedinih
proteina koji su u povećanim koncentracijama pa se iz tih razloga mora
dopuniti sličnom analizom koju nazivamo imunoelektroforeza
 Imunoelektroforeza predstavlja kombinaciju
elektroforeze
serumskih
proteina
sa
imunoprecipitacijskom detekcijom
 Elektroforezom se obezbeđuje separacija
serumskih proteina
 Imunoprecipitacijom se detektuju pojedine
imunoglobulinske klase i
drugi specifični
proteini u serumu
 Dve su srodne metode:
Imunoelektroforeza (IEF)
Imunofiksaciona elektroforeza (IFE)
Imunoelektroforeza
 IEF je pouzdan i tačan metod za
detekciju strukturnih
abnormalnosti i poremećaja u
koncentraciji proteina.
 Najčešće se primenjuje u
dijagnozi monoklonskih
gamopatija
 Najvažnija primena u ispitivanju
urina je dokazivanje Bence Jones
proteina (kapa ili lambda laki
lanci)
Imunoelektroforeza
Imunoelektroforeza je metoda kojom se pojedine komponente seruma mogu
razlikovati ne samo na osnovu njihove pokretljivosti u električnom polju, već i na
osnovu njihove antigenosti.
Izvodi se u dve faze.
Prva faza je po načinu izvođenja identična zonskoj elektroforezi. U agaru se
naprave se rupice dijametra do 2 mm u koje se stavlja serum ispitivanih osoba.
Zatim se propusti struja u određenom vrmenskom intervalu. Time se vrši
razdvajanje seruma na komponente.
U drugoj fazi se stavlja antiserum odgovarajuće specifičnosti u napravljeni
uzdužni kanal širine do 2 mm: antihumani IgG, IgA, IgM itd. Anti serum posle
određenog vremena difunduje i u područjima ekvivalencije stvara precipitate.
Pošto komponente seruma difunduju radijalno a antiserum u jednom smeru,
pericipitati imaju lučni izgled.
Imunoelektroforeza je isključivo kvalitativna metoda i omogućava samo
razlikovanje pojedinih sastojaka seruma (negde oko 30), a takođe se tom
metodom otkriva prisustvo tzv. patoloških imunoglobulina
21
precipitacija
Uzorak serum
pacijenta
+
anti humani serum
imunodifuzija
Struja
Zonska
elektroforeza
precipitacija
Imunoelektroforeza humanog seruma u agaru
(natrijum barbituratni pufer pH-8,2)
Protein
Koncentracija (g/l)
Albumin
47,6
a1 globulin
6,1
a2 -globulin
12,3
b - globulin
12,2
g-globulin
53,6
Imunoelektroforeza
Interpretacija nalaza
1. Reakcija proteina (antigena) sa antitelom
"ima/nema„ - dokazuje se prisustvo ili odsustvo proteina u
mešavini antigena
2. Promene u elektroforetskoj mobilnosti
"normalna/izmenjena"
promene u primarnoj strukturi ili
fragmentacija proteina, pri čemu
fragmenti imaju izmenjenu brzinu
u odnosu na nativni protein
Imunoelektroforeza
3. Promene u distanci preciptiranih lukova
"normalna/izmenjena"
Smanjeno rastojanje od kanala:
• povećana konc. ili prisustvo
proteina manje Mr (ubrzana
difuzija)
Povećano rastojanje od kanala:
• smanjena konc. ili prisustvo
agregata (usporena
difuzija)
4. Promene u obliku i izgledu luka
Monoklonski imunoglobulini u
monoklonskim gamapatijama
Imunoelektroforeza
LABORATORIJSKO ODREĐIVANJE AUTOANTITELA
Određivanje autoantitela je:
* kvalitativno
* kvantitativno: * titar
* arbitrarne jedinice
* koncentracija (standard)
Bazirano na imunohemijskoj detekciji:
* aglutinacija
* precipitacija
* ELISA
* turbidimetrija
* imunobloting
* imunofluorescenca
IMUNOFLUORESCENTNO ODREĐIVANJE AUTOANTITELA
detekcija autoantitela koja reaguju sa
tkivnim (intracelularnim) antigenima
Upotreba :
* tkivnih preseka (organ-specifična autoantitela)
* ćelijske suspenzije: * Hep-2 ćelijska linija (ANA)
* granulociti (ANCA)
Indirektna imunofluorescenca
 ANCA-Wegener-ova granulamatoza
 Antitela specifična za ACH receptor (Miastenija gravis)
 ANA – sistemske reumatske bolesti (SLE, polimozitis,
skleroderma, Sjogren-ov sindrom), rekcije na lekove,
hronične infekcije, RA i druge autoimunske bolesti
 Anti-fosfolipidna antitela – anti-fosfolipidni sindrom
 RF (IgM, IgA ili IgG) – reumatoidni artritis
ANCA ANTITELA
ANCA=
autoantitela specifična za citoplazmatske Ag neutrofila
* Substrat su etanolom fiksirani humani granulociti
* prisutna u naglašenim tipovima vaskulitisa
Indirektna imunofluorescencija
ANCA (At specifična za citoplazmatske Ag neutrofila)
Neutrofili (cANCA)
Citoplazmatsko vezivanje
Neutrofili (pANCA)
Perinuklearno vezivanje
ANCA AUTOANTITELA I VASKULITISI
Antigen - proteinaza-3
u primarni granulama
Wegener
granulomatoza
Antigen –
mijeloperoksidaza
Cistična
fibroza (90%),
Hronični
hepatitis (80%),
SLE, RA
Indirektna imunofluorescencija
(At specifična za Ag bazalne membrane glomerula bubrega)
Glomerulonefritis Goodpasture’s sindrom
IMUNOFLUORESCENTNO ODREĐIVANJE
ANTI-NUKLEARNIH AUTOANTITELA (ANA)
* autoantitela reaguju sa jedarni
mitotički
aparat
aparatom
centromera
ANA
* prisutna kod pacijenata sa
sistemskim bolestima vezivnog tkiva
* njihov nivo je povezan sa
intezitetom inflamacije
ENA:
ekstraktabilni nuklearni antigeni
Imunofluorescentno bojenje
anti-nuklearna antitela - ANA
oblik bojenja antigen
periferno
dsDNK
Imunofluorescentno bojenje
anti-nuklearna antitela - ANA
oblik bojenja antigen
periferno
dsDNK
homogeno
difuzno
histoni
Imunofluorescentno bojenje
anti-nuklearna antitela - ANA
oblik bojenja antigen
periferno
dsDNK
homogeno
difuzno
histoni
nukleolarno RNK
nukleolusa
Imunofluorescentno bojenje
anti-nuklearna antitela - ANA
oblik bojenja antigen
periferno
dsDNK
homogeno
difuzno
histoni
nukleolarno RNK
nukleolusa
mrljasto
ENA (ekstraktabilni nuklearni antigeni)
Sm, RNP, SS-A(Ro), SS-B (La), Jo-1, Scl-70
CENTROMERNA FLUORESCENCA
Ag: kinetohore hromozoma,
centromerni Ag (CENPA,B,C,D,E)
dsDNA
(nativna DNK)
Ag: nativna dsDNK