Transcript No Slide Title

OSNOVNE
TEHNIKE
MOLEKULARNE
BIOLOGIJE
EKSTRAKCIJA FENOLOM
solucija sa nukleinskim kiselinama
fenol
mešanje
vodena faza
proteini
faza fenola
centrifugiranje
IZOLACIJA mRNK
TTTT
AAAA
totalna RNK
TTTT
AAAA
TTTT
AAAA
TTTT
AAAA
IZOLACIJA mRNK
RNK (bez mRNK)
mRNK
ELEKTROFOREZA
ELEKTROFOREZA NA GELU
horizontalna
-
+
DNK
gel
pufer
-
+
DNK fragmenti različite veličine
vizualizacija DNK
na agaroznom gelu
ELEKTROFOREZA NA GELU
vertikalna
vizualizacija DNK na
poliakrilamidnom gelu
POLYMERASE
CHAIN
REACTION
PCR
denaturacija
hibridizacija
prajmera
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
elongacija
X 106
PCR
prajmeri
Taq
pufer
+
Mg2+
dCTP
dATP
dGTP
dTTP
x 30
94o C
56-70o C
72o C
PCR
denaturacija
uzorka DNK
94 oC , 5 ’
vezivanje
prajmera
x oC , 30’’
denaturacija
94 oC , 30 ’’
sinteza novog
lanca DNK
72 oC , x ’
PCR
5’
3’
3’
5’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
KOMPONENTE PCR REAKCIJE
DNK
ENZIM Taq DNK-polimeraza
NUKLEOTIDI
PRAJMERI
Mg JONI
PUFER
PCR
M 1
2
3
4
5
6
7
M
RT- PCR
mRNK
AAAAA
AAAAA
AAAAA
reverzna
transkriptaza
cDNK
RNK
sinteza drugog
lanca DNK
AAAAA
AAAAA
5’
3’
mRNK
AAAAA
3’
5’
OLIGONUKLEOTIDI ZA SINTEZU cDNK
oligo (dT)
mRNK
cDNK
AAAAA
TTTTT
5’ prajmer
3’ prajmer
mRNK
cDNK
random primeri
AAAAA
5’ prajmer
3’ prajmer
mRNK
cDNK
5’ prajmer
specifični prajmer
AAAAA
3’ prajmer
ODREDJIVANJE
SEKVENCE
DNK
MAXAM-GILBERT METODA
32 P
obeležena
jednolančana DNK
C C
3’
T
A C G T
metilacija guanina dimetilsulfatom
3’
32 P
C C
T
A C G T
T
A C
T
A
destrukcija riboze baznim rastvorom
3’
32 P
C C
A
odvajanje metilirane baze
zagrevanjem ili piperidinom
3’
CH3
32 P
C C
A
T
A C
obeleženi fragment
T
A
MAXAM-GILBERT METODA
32 P
C C
T
A C G T
A C C
G
T
A T G
32 P
32 P
32 P
G
A+G
C+T
C
A C
MAXAM-GILBERT METODA
G A+G C+T C
C
G
A
T
T
C
G
G
G
T
T
T
T
T
C
SANGER METODA
-O
-O
P
-O
O
-O
P
O
O
O
-O
-O
P
-O
O
O
P
-O
O
O
CH2
baza
P
O
O
P
O
O
CH2
O
O
H
H
baza
H
H
H
OH
H
deoksiribonukleozid trifosfat
dNTP
H
H
H
H
H
dideoksiribonukleozid trifosfat
ddNTP
SANGER METODA
5’
3’
3’
jednolančana DNK
5’
4 dNTPs
ddATP
ddGTP
A
G
G
ddCTP
T
G
A
A
ddTTP
C
T
T
C
C
SANGER METODA
CAGTCAGT
RESTRIKCIONI
ENZIMI
FENOMEN RESTRIKCIJE
E. coli - soj B
E. coli - soj A
l fag
plake
liza
nema lize
analiza DNK l faga
Escherichia coli R
EcoRI
Providencia Stuarti
PstI
Haemophilus
parainfluenzae
HpaI
Haemophilus
influenzae
HindIII
RESTRIKCIONE ENDONUKLEAZE
’’blunt ends’’
5’
G
T
T
A
A
C
3’
3’
C
A
A
T
T
G
5’
HpaI
’’sticky ends’’
Eco RI
Hind III
5’
G
A
A
T
T
C
3’
5’
A
A
G
C
T
T
3’
3’
C
T
T
A
A
G
5’
3’
T
T
C
G
A
A
5’
Bam HI
Pst I
5’
C
T
G
C
A
G
3’ 5’
C
G
A
T
C
C
3’
3’
G
A
C
G
T
C
5’ 3’
G
C
T
A
G
G
5’
5’
3’
T T AA
5’
3’
+
A A TT
T T AA
A A TT
3’
5’
3’
5’
RESTRIKCIONA MAPA
10 kb
restrikcioni
enzim A
restrikcioni
enzim B
restrikcioni
enzimi A i B
2 kb
3 kb
2 kb
8 kb
7 kb
3 kb
5 kb
A
2 kb
B
5 kb
3 kb
SOUTHERN BLOT
SOUTHERN BLOT
restrikcioni
enzim
DNK u nativnoj formi
elektroforeza
Oko 106 fragmenata DNK
membrana
gel
pufer
(SSC 20x)
transfer DNK na membranu
denaturacija u
baznom rastvoru
PREHIBRIDIZACIJA
salmon sperm
membrana za koju se vezala DNK
autoradiografija
ispiranje
SSC
trake odgovaraju fragmentima
hibridizovanim sa sondom
HIBRIDIZACIJA
sa radioaktivnom
sondom
dekstransulfat +
formamid
42 oC
SOUTHERN BLOT
C
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
MARKIRANJE
SONDI
NICK - TRANSLACIJA
5’
3’
3’
5’
DNaza I
5’
3’
3’
5’
5’-3’ egzonukleazna
aktivnost
DNK polimeraza I
5’
3’
3’
5’
dCTP
dGTP
dTTP
dATP
polimerazna
aktivnost
5’
3’
3’
5’
radioaktivna sonda
sonda
DNaza I +
DNA pol I
dCTP
dATP
dGTP
dTTP
Sephadex
mikrokolona
radioaktivnost
inkubacija u vodenom
kupatilu na 15oC
markirana
sonda
slobodni
nukleotidi
pul radioaktivnih frakcija
rastvorenih iz kolone
frakcije
’’RANDOM PRIMING’’
sonda
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
zagrevanje na 100 oC + 5’
brzo rashladjivanje na ledu
3’
5’
3’
hibridizacija
na 25oC sa
’’random’’
prajmerima
dCTP
dGTP
dTTP
dATP
3’
5’
Klenow
fragment DNK
polimeraze I
5’
3’
obeležena
sonda
MARKIRANJE OLIGONUKLEOTIDA
oligonukleotid
5’
3’
P
OH
T4
polinukleotid
kinaza
5’
g
b
a
P
P
P
g 32 P ATP
3’
OH
P
obeležen oligonukleotid
riboza
adenin
NORTHERN BLOT
DOT-BLOT