Transcript Chromatography

2009. 10. 27.
Chromatography
(천연물 추출과 관련된 chromatography 공정)
환경생물공학연구실
이승희
Content
 Chromatography의 개요
 Chromatography의 원리
 Chromatography 의 종류
 Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정
 Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정의 예
Chromatography의 개요
• 크기, 전하, 흡착성 또는 생물학적 친화성(affinity)의 차이에
근거를 두고 미세한 입자를 충전시킨 컬럼을 통하여 유체를 균
일하게 침투 통과시키는 과정에서 유체 내 어떤 성분이 선택적
으로 지연되어 결과적으로 물질이 분리
• Chromatography의 어원: Tswett(1903년)이 식물의 색소를 분
리하며 사용(chroma, Greek어로color를 뜻함). 오늘날은 색깔
과는 무관하게 화학물질(chemical species)을 분리하는 기술을
의미.
• 생체분자들(biomolecules)은 다양한 범위의 크기, 모양,
hydrophobicity 등을 갖기 때문에 이들을 분리할 때 한가지
chromatography 방법만으로 불충분→두 가지 이상의
chromatography법 이용
Chromatography의 원리
• 한 물질을 두 가지상(two-phase)으로 이루어진 시스템(예: liquid-liquid,
liquid-solid)에 적용시키는 경우, 이 물질의 열역학적 특성 및 상들의 특성에
따라 두 상들에 다른 농도로 분포
 Liquid-liquid system
: 각각의 액상에 대한 상대적인 용해도가 partitioning에 영향
 Liquid-solid system
: 고체상에의 흡착(adsorption)이 partitioning에 영향. 물질들의 고체상과의
상호작용(hydrophobic interaction, ionic interaction, 기타)이 흡착에 영향
을줌
• Column chromatography: solid를 column에 충전하여 분리하는 방법으로, 이때
solid를 정지상(stationary phase), liquid를 이동상(mobile phase)이라고 함.
Chromatography의 원리
• 각 분자의 상대적 움직임은 이동상의 움직임과 이동상의
움직임 지연효과들 사이의 균형의 결과이다. 이러한 지연
효과들은 분배(partition)와 흡착(adsorption)에 따라 달라
진다.
• 분배(partition) : 일반적으로 두 상이 동일한 용질을 포
함한다면 용질은 두 상 사이에서 서로 다른 농도비로 분포
하게 될 것이다.
시료 A
시료 B
시료 C
컬럼에 채워져 있던 용매
검출기
이동상
Chromatography의 원리
• 용질은 두 상에서의 각각 다른 농도비를 가지는데 정지상과 이동상에서의 시
료물질의 partition되어 있는 농도비를 partition coefficient(분배계수)라고 하
며 K로 표시.
K = Cs/Cm
Cs: 정지상에서의 시료농도
Cm: 이동상에서의 시료농도
• 물질마다 독특한 분배계수를 가짐→ column에서 다른 속도로 이동→ 분리가
이루어짐.
•Temperature, solvent polarity 등이 K값에 영향.
Chromatography의 원리
• 용질이 고체 표면에 흡착하는 정도는
Freundlich을 통하여 용질의 농도와 흡
착량의 상관관계를 나타내는 흡착등온
선 (isotherm)으로 나타낼 수 있다.
q = KFCn
q : 흡착량 (Kg/m3, mol/m3)
KF : Freundlich 평형상수
C : 농도 (Kg/m3, mol/l)
n : 지수
그림 1-1. 흡착 등온선
• 일반적인 흡착등온선은 A와 같은 곡선이지만 용질과 흡착제와의 특성에 따
라 다르게 나타날수 있고 물질의 이동속도는 정지상과 결합 세기에 따라 차이
가 있다. 즉, 강한 흡착력을 갖는 물질은 더 느리게 움직인다.
 흡착 (adsorption) 이론 : 서로 다른 흡착 등온선을 갖는 물질은 정지상에 대
한 서로간의 지연정도가 다르기 때문에 분리될 수 있다.
Chromatography의 원리
 Partition chromatography mode: 시료물질들이 고체상을 통과하면서 분리
됨(예: gel filtration)
 Adsorption chromatography mode: 시료물질들이 먼저 고체상에 흡착되
고 나중에 분리됨(예: ion exchange chromatography).
Chromatography의 원리
※ Chromatography에서 이용되는 고체상 물질들
Chromatography의 종류
• 크로마토그래피는 컬럼 충진물인 고정상과 분리하고자 하는 성분들을 포함하
고 있는 유체 유동상 간의 상호 작용 기작을 이용한 기술. 적용되는 상호작용 기작
에 따라서 다음과 같은 다양한 chromatography로 사용
 Gel chromatography - 크기의 차이에 근거를 두고 분리
 Ion exchange chromatography - 이온교환수지의 흡착성을 기준
 Affinity chromatography- 분자간의 친화성에 근거
 Hydrophobic interaction chromatography
- 용질분자와 지지체(matrix) 위의 작용기 사이의 소수성 상호작용
 Paper chromatography
 Thin-layer chromatography, TLC)
 Gas chromatography, GC)
 High performance liqiud chromatography, HPLC)
Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정
 생물공정의 분리 및 정제 기술
 바이오 의약품
면역단백질 분리∙정제
 생물화학 공업
생물화학 공업의 다양한 효소
 식품생명공학
기능성 식품소재 및 각종 첨가물
 농업생명공학
농약 및 동물 백신류 등을 제조
 화장품 산업
식물 추출물, 향료, 발효생산물 등에서의
항산화제 추출 및 미백제 성분 추출
• Gel (filtration) chromatography
• Ion exchange chromatography
• Affinity chromatography
• High performance liquid chromatography, HPLC)
Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정
 Ion exchange chromatography: 음이온들이나 양이온들이 교환수지라고 하
는 정지상에 공유결합 되어 있는 이온교환수지를 이용하여 이동상에 있는 반
대 전하의 용질 이온들이 정전기적 인력으로 정지상에 이끌리므로 흡착되어
분리가 이루어짐.
• 주로 단백질 정제를 위해 사용
되며 단백질이나 아미노산의 분
석적인 분리에 응용.
예) 할로겐화물 이온은 Dowex2 컬럼으로 pH 10.4의 1M에서
NaNO3(NaOH로 조절)을 용리
액으로 사용하면 F-,CI-,Br-, I-순
으로 분리 됨.
그림 1-2. 단백질의
Ion exchange chromatography
Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정
 A typical ion-exchange experiment
• 만일 시료가 높은 농도
의 counter ion (예: 옆
그림의 Cl-)을 포함하고
있으면 dialysis, gel
filtration 등을 통해
desalting을 한 후 이온
교환크로마토그래피에
적용
Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정
 Gel (filtration) chromatography : 단백질, 펩티드, 핵산, 호르몬, 다당류들의
분리에 이용. 고농도의 염으로 염석되어 분리된 단백질 분획으로부터 염을 제
거하는 데 유용.
• 세파덱스(Sepahadex)- 단백질 분리
에 잘 사용되는 겔. 다당류이고 큰 고
분자 사슬에 있는 수산기 때문에, 매우
극성이며 많은 물을 흡수. 이들 겔은
물에 녹지 않으며 약한 산화제, 환원제,
약한 염기에 대해서 안정.
• 바이오-겔 P (Bio-Gel P)- 화학적으로
불활성한 분자체 겔, 아크릴아미드 중
합물.물에 녹지 않으며, 보통의 유기
용매에도 녹지 않음. pH 2-11의 범위에
서 사용
Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정
입자직경a (μ)
분획 범위
(MW)
물의 재흡수
(ml/g dry gel)
겔 부피
(ml/g dry gel)
Sephadex G-10
40 - 120
700
1.0 ± 0.1
2-3
Sephadex G-15
40 - 120
1,500
1.5 ± 0.2
2.5 - 3.5
Coarse
100 - 300
1,000 - 5,000
2.5 ± 0.2
4-6
Medium
Fine
Superfine
50 - 150
20 - 80
10 - 40
Coarse
100 - 300
1,500 - 30,000
5.0 ± 0.3
9 - 11
Medium
Fine
Superfine
50 - 150
20 - 80
10 - 40
3,000 - 70,000
7.5 ± 0.5
12 - 15
4,000 - 150,000
10 ± 1.0
15 - 20
5,000 - 400,000
15 ± 1.5
20 - 30
5,000 - 800,000
20 ± 2.0
30 - 40
구분
Sephadex G-25
Sephadex G-50
메쉬
(mesh)
Sephadex G-75
40 - 120
Superfine
Sephadex G-100
10 - 40
40 - 120
Superfine
Sephadex G-150
10 - 40
40 - 120
Superfine
10 - 40
Superfine
40 - 120
10 - 40
Sephadex G-200
Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정
구분
Bio-Gel P-2
Bio-Gel P-4
Bio-Gel P-6
Bio-Gel P-10
Bio-Gel P-30
Bio-Gel P-60
메쉬
(mesh)
50 - 100
100 - 200
200 - 400
400
50 - 100
100 - 200
200 - 400
400
50 - 100
100 - 200
200 - 400
400
50 - 100
100 - 200
200 - 400
400
50 - 100
100 - 200
400
50 - 100
100 - 200
400
입자직경a (μ)
150 - 300
75 - 150
40 - 75
40
150 - 300
75 - 150
40 - 75
40
150 - 300
75 - 150
40 - 75
40
150 - 300
75 - 150
40 - 75
40
150 - 300
75 - 150
40
150 - 300
75 - 150
40
분획범위
(MW)
200 - 2,600
물의 재흡수
(ml/g dry gel)
1.5
겔 부피
(ml/g dry gel)
4
500 - 4,000
2.4
6
1,000 - 5,000
3.7
9
5,000 - 17,000
4.5
12
20,000 - 50,000
5.7
15
30,000 - 70,000
7.2
20
Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정
Bio-Gel P-100
Bio-Gel P-150
Bio-Gel P-200
50 - 100
100 - 200
400
50 - 100
100 - 200
400
50 - 100
100 - 200
400
150 - 300
75 - 150
40
150 - 300
75 - 150
40
150 - 300
75 - 150
40
40,000 - 100,000
7.5
20
50,000 - 150,000
9.2
25
80,000 - 300,000
14.7
35
Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정
 Affinity chromatography : 용질분자와 지지체 위에 결합되어 있는 리간드
(ligand)사이의 특이한 화학적 상호작용에 의해 분리.
• 효소, 항원, 특이적 핵산, 비
타민 결합 단백질, 약 호르몬
수용체 같은 물질을 순수 분
리할 때 자주 이용.
• 지지체에는 아가로오스 담
체(beads), 폴리아크릴아마이
드 담체, 조절된 다공성
(controlled porosity) 유리
담체 등이 있다.
그림 1-3. Affinity chromatography
Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정 예
1. 대구고니 단백질의 효소적 가수분해물로부터 항산화성 펩타이드의 분리∙
정제 및 특성
한외여과막
• 항산화제란 산화를 방지하거나
지연시키는 물질.
Ion exchange chromatography
• 각종 식물 추출물, 향료, 발효생
산물 등에 α-tocopherol과 그 유
도체 등의 flavonoid 또는 페놀계
화합물로 대부분 존재.
• 동물성 단백질 및 식물성 단백질
을 효소 분해하여 얻어진 펩타이드
에서도 항산화 활성을 나타냄
Gel chromatography
분광광도계(280 nm) 흡광도 측정
HPLC
모세관 전기영동
Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정 예
Fig. 7
Fig. 9
Fig. 11
Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정 예
2. 키토산 및 키틴 막을 이용한 다공성 친화막 제조와 특성 평가에 대한 연구
 친화관 크로마토그래피는 마이크론 크기의 hydrogel bead 담체에 리간드
(ligand)가 결합된 고정상 입자를 채운 충전관을 사용하여 분리대상 목적물
인 리게이트(ligate)와 리간드와의 친화작용에 의해 물질을 분리 정제하는
방법.
 충전관은 공극률이 낮아 압력강하가 크며(약 3 atm/cm depth), 관을 통한
이동상의 유동략이 작아 확산저항이 커서 분리정제의 생산성이 낮다는 문
제와 공극 막힘(plugging)의 발생이 쉽기 때문에 이를 규모 확대시켜 생산
규모에 적용하는 어려움.
 충전관이 갖는 문제점을 개선하기 위한 방안의 하나로서 다공 막을 리간드
의 고정화 담체로 사용하는 친화 막(affinity membrane)에 대한 연구
 친화 막 크로마토그래피 기법은 관 크로마토그래피의 장점과 막분리의 장
점을 결합시킨 분리기법
Natural Products 추출에 이용되는 Chromatography 공정 예
• MF 또는 UF막의 세공 내에 리간드를
고정화시킴으로서 통상의 여과 막에 분
자 특이성 또는 선택성을 부여하고 친
화 막이 장착된 막 모듈을 hydrogel
bead 충전관 대신 사용하면 막 세공을
통한 이동상 흐름이 커서 분리정제의
생산성 증대와 규모 확대를 기대.
• 기계적 강도가 적절하고, 필름형성이
용이, 분자구조에 수산기(-OH) 및 아민
기(-NH2 )를 갖고 있어 리간드와의 결
합력이 우수하여 친화 막제조의 소재로
서 활용할만한 가치.
• 기토산 용액에 기공 형성제(porogen)
로서 실리카 입자를 사용하여 세공특성
조절이 가능한 키토산 및 키틴 막의 제
조법을 개발.
그림 1-4. Schematics of affinity
membrane