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질량분석기의 원리 (FAB, ESI, APCI이온화법 및 Sector type 질량분석기의 원리) Schematic Diagram of Mass Spectrometer Vacuum System Inlet System Reservoir DIP GC LC Ion Source EI CI FAB API ESI Mass Analyzer Magnetic Secter Quadrupole Ion trap TOF Detector Data Processor Print out SAMPLE ANALYSIS by MASS SPECTROMETRY SAMPLE Single component Mixture Multiple component vaporizable vaporizable Y Y N DIP -EI -CI DIP -FAB -ESI MALDI GC/MS -EI -CI vaporizable N Vaporizable + nonvaporizable LC collection non- -FAB -ESI MALDI nonvaporizable LC/MS -ESI -APCI Ionization modes NAME YEAR IONIZATION AGENT Electron Ionization (EI) 1920 Energetic Electrons Chemical Ionization (CI) 1965 Chemical Reagent Field Desorption (FD) 1969 High Electrode Potential Field Ionization (FI) 1970 High electrode Potential Plasma Desorption (PD) 1974 Secondary Ion Mass (SIMS) 1977 Secondary Ions Laser Desorption (LD) 1978 Laser Beam Thermal Desorption (TD) 1978 Heat Fast atom bombardment (FAB) 1981 Fast Atom Thermospray (TSP) 1985 Thermospray of Liquid Electrospray (ESI) 1989 Electro Potential Matrix-assisted Laser Desorption (MALDI) 1990 Laser Beam 252Cf Fission Fragment FAB(Fast Atom Bombardment) • FAB는 최소의 fragmentation을 이용하는 soft ionization기술 중의 하나 • 극성이며 열에 민감한 시료에 적합하며 생물학적 고분자량 물 질의 연구에 중요한 이온 생성 법. • 대부분의 질량분석기에 장착할 수 있지만 Sector type 질량분 석기에 적당 • 1nanomole의 적은 양의 분석시료도 검출이 가능 FAB Ionization FAB의 이온화과정 • FAB ionization에서 sample droplet은 8-10 keV의 에너지를 갖은 atom(Ar, Xe)과 충돌 • 충돌에서 액체상태의 시료가 gaseous ions으로 상전환되는 sputtering-matrix내에서 다단계 충돌에 의해 초기 고에너지 입자로분터의 운동량의 재분배가 일어남 • 충돌의 생성물로 양이온 형성 모드에서 protonated molecular ions(M+H)+ 혹은 cationized species(M+Na)+형성 • 음이온 모드에서 (M-H)- 등 시료의 표면에서 발생됩니다. Matrix • 탈착 이온화가 일어나는 동안 분석물질과 혼합해서 사용하는 액체 매트릭스는 FAB에서 핵심적인 분야이다 • 일반적으로 시료는 Glycerol, 3-nitrobenzyl alcohol, triethanolamine 등이 사용된다 • Matrix의 기능 - freezing point가 낮아서 시료가 고진공 상태의 ion source로 유입될 때, 액체상태를 유지할 수 있도록 함. - 높은 에너지의 충격입자로 인하여 시료가 받는 damage를 줄 여줌 FAB 분석의 장단점 • 장점: 작동이 빠르고 spectra의 해석이 용이 • 단점: 고농도의 유기용매(예, 80-95% glycerol)가 사 용되므로 sensitivity에 한계가 있고, 어떤 경우 는 matrix solvent에서 생성된 cluster ion이 대부분의 spectrum을 차지합니다. Continuous flow FAB(CF-FAB) • 기존 FAB의 문제를 많이 해결 • Matrix와 시료를 probe tip에 적용하는 대신, probe가 연속 적으로 sample solution을 일정 유속으로 target에 공급 • 소량의 organic matrix를 사용하게 되며, 더 낮은 chemical background로 signal-to-noise ratio를 증가시킬 수 있도 록 함. • CF-FAB의 가장 큰 장점은 HPLC 혹은 capillary electrophoresis의 연결에 유용 ESI (Electrospray Ionization) • Electrospray 기술은 유용한 Mass range를 분자량 50,000 이상 • • 으로 확장시킨 이온화방법으로, 금세기 초 liquid를 전기적으로 분 산시키는 기술에서 출발 • sample solution을 small tube로부터 nitrogen 흐름 속의 강력한 전기장으로 spray해서 ion을 발생 • • Spray 형성은 ES의 핵심기술인데, 전기적인 오작동 및 operating 의 안정성을 위해서 solvent는 모두 filtering 하여야 하며, 전해질 농도는 높지 않게 하여야한다 • ESI는 대부분의 mass분석기와 연결해서 사용가능 Most Organic Compounds are not Suitable MECHANISM OF ESI • 시료가 SS Nedle을 통해 ES chamber에 들어옴 • Capillary tip으로부터 liquid가 electrostatic dispersion 되어서 droplet이 spray 됨 • bath gas(nitrogen)에 의해 declustering 되면서 solvent 분자를 소실하여 각각의 ion형성 Electrospray ion의 형성 + + + + Evaporation + + + + + ++ +` + ++ + + + + ++ + + + + ++ ++ ESI source SCHEMATIC OF ESI ION SOURCE ESI spectra를 이용한 MW 계산 • • ESI 이온화시 잔류용매에 있는 과량의 양성자에 의해 분석물질은 다가 이온으로 변할 수 있음 Assume a molecule of mw = 900 ESI spectrum yields ions that appear to carry 1, 2 & 3 charges M + H+ MH+ 901 M + 2H+ (MH2)+2 451 M + 3H+ (MH3)+3 301 mw = [(m/z)* charge state] – charge state mw1 = (901*1) – 1 = 900 mw2 = (451*2) – 2 = 900 mw3 = (301*3) – 3 = 900 ESI의 장점 • 거의 모든 시료에서 이온화가 가능 • 실제 분자량의 1/10, 1/30에 해당하는 M/Z 값을 볼 수 있음 - 측정 가능한 분자량의 범위는 기기의 명목상 측정 범위 보다 큰 분자량을 측정할 수 있다. • ESI는 다중 전하물질을 생성하므로 다중의 m/z 값을 평가하 면 0.01%의 정밀도로 실제 분자량을 계산할 수 있다. - 38,842의 거대 분자를 ±4의 정밀도로 분자량 측정이 가능 • ESI는 아주 좋은 감도로 분석이 이루어지기 때문에 20femtomol 정도의 시료로 단백질 측정이 가능하다 - 단백질 분자량 측정시 10,000의 분자량을 가진 시료는 20g 정도면 분석이 가능 ESI의 단점 • 모든 유기물화합물에 적용하기 어렵다. • -------> ionic, polar • spray의 형성이 buffer, salt 농도에 민감하게 영향을 받음 • Spectra can be influenced by solution and gas-phase chemistry occurring in the ES source ESI 분석용 용매 Suitable Water Methanol Ethanol n-Propyl alcohol Isopropyl alcohol t-Butyl alcohol Acetonitrile Acetone Pyridine Tetrahydrofuran Aniline Nitromethane Acetic acid Chloroform Hexamethylphosphoretriamide N-Methylformamide Dimethylformamide Dimethyl sulfoxide Dichloromethane 1,2-Dichloroethane Tetrachloroethane Not suitable Benzene Toluene Ligroin Carbon tetrachloride Carbon disulfide Styrene Formamide Hexane Cyclohexane APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) • APCI는 1973년 Horning에 의해 최초 개발되었음 • 이온화는 대기압하에서 질소기류 중에 LC에서 용출한 액을 가열하 여 기화 시켜 이온화를 발생 • APCI의 이온화방법으 원리적으로 CI와 같음 -시료 중의 용매가 CI과정에서 반응기체의 역할을 함 APCI Mechanisms Vaporation ---> Solvent ionized ----> Charge transfer to analyte APCI Source LC/MS interface When to use of APCI • 시료에 산이나 염기성 물질이 없느 경우. • 시료가 휘발될 수 있는경우. • • 유량, 용매 등의 조건이 electrospray에 맞지 않는 경우. • 시료가 electrospray 반응에 약할 경우 • Ease of operation/ruggedness of API-MS method ESI, APCI, CI의 mass spectro ESI와 APCI의 비교 Mobile phase : APCI가 유량, 용매에 영향을 덜 받는다. Spectral information : 둘다 물질의 구조를 알 수 있지만, APCI는 열분해 또는 고온 probe에 의하며, ESI는 비휘발성 물질에서 더 좋은 분석법이다. Sensitivity : APCI는 휘발성이 있고 안정적인 물질 분석에 적합하며, ESI는 ionic 또는 amine류 분석에 적합하다. Operating parameters : APCI - temperature, ESI - pH Mass Analyzers의 종류 • Magnetic Sector Analyzer ; Single Focusing, Double Focusing • Quadrupole Mass Analyzer • Time of Flight Mass Analyzer HRMS Analyser Magnetic Sector Analyzer • 최초의 Mass Spectrometer는 20세기 초에 J.J.Thomson이 Ne 의 동위 원소 분석을 위해 사용 • 자기 섹터 질량분석기에서 모든 이온은 동일한 운동에너지(KE) 2 로 가속 되며, 이때 KE=1/2(mv )이므로 이온들의 질량이 다르 면 운동속도가 달라짐 • 전하를 띤 입자들이 자기장 속에서 90의 힘을 받으며 휘어진 경 로를 지나간다. 이 경로의 곡률은 전하를 띤 입자의 질량×속도 에 비례 • 검출기에 도달하는 이온의 m/z와 자기장과의 관계식은 2 2 m/z=R H /2V R=곡률반경(일정), H=자기장의 세기, V=가속전압 • Mgnet sector type의 질량분석기는 고정된 자석 반 경에서 최대 자기장의 세기, 최대 가속 전압을 제어함 으로써 가능한 한 최대범위의 m/z 값을 측정할 수 있 다. • 자기장이 일정할 때 가속전압을 감소 시키면 검출되 는 m/z값의 범위가 증가 하지만 통과하는 이온수가 적어져 검출한계가 감소하게 된다. • - 최대로 줄일 수 있는 가속전압은 최대 50% 정도 • Sector type의 질량분석기는 0.1m/z 질량차이를 측 정할 수 있다. Single-focusing magnetic-sector MS Double focusing type Double focusing type • Double focusing = Magnetic sector + Electric sector • 이온이 가속되는 과정에서 같은 질량이지만 서로 다른 운동에너지를 갖는 입자가 발생하면 focusing에 문제가 발생 -Focusing의 향상( resolution의 향상)을 위해 electric analyzer를 magnet sector의 앞부분에 장치 • 동일한 운동에너지를 갖는 입자를 집속시켜 자기장 으로 보냄 - 질량차가 미세한 입자들을 분리 • Electric sector는 두개의 전장으로 구성되어 있으며, +이온 분 석시 외부는 +전위, 내부는 –전위가 작동 함. • Electric srctor는 동일한 에너지를 갖는 이온을 선택하기 위하여 사용 - 초기 이온은 0-3eV의 운동에너지를 가지며 분석관으로 향함. - 3,000V로 가속된다면 운동에너지는 2,997eV에서 3,003eV의 값을 가짐 -이중 초점 질량분석관에서 Electric secto는 3,000±‘3 eV를 갖는 이온만이 검출됨. High resolution • Resolution (Rs = m/Δm) Low Rs 100 < Rs <1000 Medium Rs 2000 < Rs <10000 High Rs 10000 < Rs Δm = 1 ( unit Rs ) 0.01 < Δm < 1 Δm < 0.01 40㎜ H 50% 10㎜ h M2 M1 h / H ⅹ100 = 10% Rs = M / Δm = M1 / (M2-M1) 300 301 (m/z) Rs = M / Δm = 300/(1ⅹ(10/40)) = 1200 • C5H8O와 C6H12의 분석 • 두 시료모두 m/z는 84로 동일 • 유기 질량분석법에서 자연계에서 존재하는 일반적인 원소의 질 질량은 H - 1.0078 C - 12.0000 O - 15.9949 F - 18.9984 Cl 35 - 34.9689 • C5H8O=84.0573, C6H12=84.0936으로 36.3mmu의 차이가있 음 • 동시에 존재하는 두 물질을 분리하려면 최소 9,000이상의 분해 능이 필요 • 물질의 최종 분자식 확인 시 시료를 R=10,000에서 분석하여 error가 1ppm 이내가 되어야 함.