Column Basic Theory

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베너 테크놀로지(Bene-Tech)

KOREA Authorized YMC Distributor • YMC 사: HPLC/MS /Prep Columns Packing Materials Solid Phase Extraction Big Scale Prep Sys  BENE TECHNOLOGY . 2008

목 차

• • • • • • 컬럼 위한 HPLC 기본이론 컬럼 사용 위한 Solvent Delivery System들 (Pump) 컬럼 사용시 Injector 컬럼에 연결되는 Detectors Column 컬럼 위한 분리능 & 이동상  BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼 위한 LC 기본이론

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Chromatography

란

?

혼합된 시료성분이 이동상과 고정상 사이를 흐르면서 흡착, 분배, 이온교환 또는 분자크기 배제작용 등에 의해 각각의 단일성분으로 분리되는 것을 말한다. 분리, 정성, 정량 등의 분석목적 과 분리, 정제, 분취 목적에 이용 Injection Interaction Elution abacbc aabcbc a  BENE TECHNOLOGY . 2008

Chromatography의 종류

• Gas Chromatography – – – – – 이동상 : 기체 시료의 휘발성 분자량 < 500 열에 대한 안정성 고려 고정상과 시료의 화학적 친 화력 및 b.p차에 의한 분리 • Liquid Chromatography – – – – – – 이동상 : 액체 시료의 용해성 분자량 범위가 넓다.

상온근처에서 분석한다.

Ionic compound분석도 가 능 고정상 및 이동상과의 상호 친화력에 의한 분리  BENE TECHNOLOGY . 2008

분자량에 따른 Chromatography의 비교  BENE TECHNOLOGY . 2008

HPLC System의 구성

Mobile Phase Reservoir Pressure Gauge Data System Pump Pulse Damper Injector Column Detector Fraction Collector Gradient Device

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컬럼 사용 위한 Solvent Delivery System들 (PUMP)

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Solvent Delivery System (Pump)

• • • 용매 저장용기에서 용매를 끌어서 시료주입기로 밀어주는 역할 Pump의 요건 – – 일정한 유속과 압력유지 가동이 쉽고 다양한 용매를 사용할 수 있어야 함 Pump의 특징 – – – – – 정확한 유속과 유량 조절 Pulse 방지를 위한 system 가동이 쉽고 여러 용매 사용 가능 Isocratic / Gradient까지 사용 내구성이 우수  BENE TECHNOLOGY . 2008

이동상 조성에 따른 분류

• 일정용매 조성법 (Isocratic Mode) : 분석시간동안 용매의 조성이 바뀌지 않는다. • 구배 용매 조성법 (Gradient Mode) : 분석시간 동안 용매의 조성을 여러 가지 형태로 바꾸어 줄 수 있다.

– – Single pump ; Low pressure Multiple pump ; High pressure  BENE TECHNOLOGY . 2008

일정용매 조성법

pump detector solvent reservoir injector column • • • 가장 간단한 형태의 구성 한 Pump가 일정조성의 용매를 밀어줌 실험 중 용매의 조성이 바뀌지 않음 ---  BENE TECHNOLOGY . 2008

구배용매 조성법 (I)

• • 분석동안 용매의 조성을 바꾸어 줄 수 있음 시간에 따른 변화 및 그 형태까지도 변화시킬 수 있다.

1) Single pump - Low Pressure - Helium sparging ,Degassing 반드시 해야 한다.

solvent A solvent B  BENE TECHNOLOGY . 2008 mixer pump

구배용매 조성법

(II) 2) Multiple pump – High Pressure Pump A solvent A solvent B Pump B Mixer  BENE TECHNOLOGY . 2008

Pump 작동시 주의사항

 사용 용매의 탈기   용매가 없는 상태에서 Pump on 하지 말 것 Buffer 사용 후 물로 충분히 세척  다른 용매를 사용하는 경우 섞임성 확인    Pump priming 실시 Pulse 없는 상태로 계속적인 용매 흐름 조절 Pump 압력 확인 ( 높은지 , 낮은지 , 일정한지 확인 )  BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼사용시 Injector

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Injector

• 이동상에 시료를 Loading 하여 Column으 로 보내는 역할 • Injector 의 종류 – Rheodyne Injector (Valve Injector) – Automatic Injector  BENE TECHNOLOGY . 2008

Injector 작동시 유의사항

• • • • • • • 잘 세척된 Syringe 사용 시료 주입시 기포는 완전히 제거 Syringe 세척은 시료가 잘 녹는 용매를 사용 강한 세척 요구 시, 사용용매  Dichloromethane 순으로 세척 Acetone  Auto injector needle wash 용 용매 사용 시 주의 시료확산을 방지하기 위해 injector와 column, column과 detector사이 연결을 짧게 연결(0.009inch) 잘못된 Tubing 연결 시 dead volume 생김.

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Rheodyne Injector

• • • 주입량이 loop에 의해 정해짐 Loop 를 교체하여 주입량 변화시킴 Sample loop 세척이 요구 Load 1 2 Pump 1 Inject 2 6 3 Column 6 3 4 5 Sample Loop 5 4  BENE TECHNOLOGY . 2008

Auto Injector

• • • • • • Free injection하여 생산성을 향상 조건입력 가능 무인 가동할 수 있으므로 분석 시간 단축 온도 조절을 통해 시료의 변성 가능성을 최소화 시료의 주입량의 오차가 거의 없으므로 재현성 우수 Auto priming 및 Auto needle washing이 가능함  BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼과 연결되는 Detector 들

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Detector의 종류

• Optical Detector – – – UV/Visible Detector Fluorescence Detector --- a.

--- b.

Refractive Index Detector --- c.

• Electrochemical Detector – – Conductivity Detector Electrochemical Detector --- d.

--- e.

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여러 가지 Detector의 특징

Response RI Universal UV/Vis Selective Sensitivity (typical) Flow sensitivity Temperature sensitivity Microgram YES YES Nanogram NO NO Fluorescence Electro chemical Conductivity Selective Selective Selective Picogram NO NO Picogram YES YES Nanogram YES YES  BENE TECHNOLOGY . 2008

A. UV/Vis Detector

• 광원에서 특정 파장의 빛이 광이나 장치를 거쳐 cell내의 시료에 투 사되면 일부는 흡수되고, 일부는 시료를 통과하게 되는데, 특정한 시 료는 특정파장의 빛에 대한 흡광도가 높아서 시료를 투과하는 빛의 강도는 상대적으로 작아지게 된다.

• 이 때 흡수되는 빛의 양(A)은, – – – – 용액내의 흡광 시료의 농도 (C)에 비례하고 빛의 파장과, 시료의 특징적인 흡광 spectrum(Molar Absorptivity), 빛이 시료를 통과하는 거리 (path length, b) 와 관계가 있다.

A = Ebc

(Lambert-Beer Law)  BENE TECHNOLOGY . 2008

A. UV/Vis Detector (cont.)

• UV Cutoff of Common Solvent Solvent UV Cutoff Solvent UV Cutoff Water Methanol n-Propanol Acetonitrile THF Acetone Methyl acetate Ethyl Acetate Nitromethane 180 210 205 190 n-Heptane Cyclohexane Carbon tetrachloride Chloroform 230 330 260 Benzene Toluene Methylene chloride 260 Tetrachloroethylene 380 1,2-Dichloroethane  BENE TECHNOLOGY . 2008 197 200 265 245 280 285 232 280 225

B. Fluorescence Detector

• 원리 – Excitation filter를 통과한 빛은 sample cell에 존재하고 있는 시료 분자 를 excited state로 만들어 준다.

– – – 이 시료분자가 Ground state로 떨어지면서 흡수한 파장보다 긴 파장 의 빛을 방출하게 된다.

시료는 분자구조가 형광성을 띠거나 형광 유도체를 만들었을 때 이용 발광하는 빛의 양은 시료의 농도에 비례하며 발광량에 따른 전기적 신 호의 크기가 정량의 척도가 된다.

• 형광 물질 – – – Benzene 고리 치환물 중 작용기가 -OH, -OCH3, -H2, -NH(CH3), N(CH3)2, -F, -CO등인 화합물 Poly-aromatic hydro-carbons, Carbamate pesticides , Alfatoxins, Vitamins and Amino acids Chemically derivatized compounds which are not normally fluorescing  BENE TECHNOLOGY . 2008

C. RI Detector

• 원리 – – 시료의 농도 변화에 따른 굴절률을 측정한다.

Reference cell은 이동상으로 채워지고, 분석시간동안 이동상은 sample cell만을 통과하면서 흐른다. • 응용 범위 – – 굴절률에 의하여 분석하므로 거의 모든 물질에 사용 할 수 있으 나 주로 고분자, 당 등의 분석에 이용된다.

일반적으로 UV/ Visible, Conductivity검출이 어려운 시료에 이용 한다.

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D. Electrochemical Detector

• 원리 – – – – 검출기의 Working electrode와 시료 사이의 전기화학 반응 : 산화/환원 반응으로 인한 current의 차를 측정 작은 DC전압이 working electrode에 걸리면서 working electrode에 접 촉된 시료성분이 산화 환원을 일으킨다. 산화 환원으로부터 발생된 electrolytical current가 측정되고, 이것은 analog signal로 출력하게 된 다.

비교적 낮은 전위에서 수용액 내에서 산화반응이 쉽게 일어나는 이온의 검출에 사용된다.

환원반응은 대체로 적당하지 않은데, 이는 용존 산소를 제거해야 하는 번거로움이 있기 때문이다. • 이용범위 – Catecholamine, 뇌조직 내 신경전달물질의 산화, phenolic compound와 쉽게 산화되는 무기 착화합물 등  BENE TECHNOLOGY . 2008

D. Electrochemical Detector

• Working electrode – Silver (Ag) – Glassy Carbon – – Gold (Au) Platinum(Pt) Iodide, Sulfide, Cyanide Phenolic compound catecholamine Carbohydrate Hydrazine, OCl ,Alcohols  BENE TECHNOLOGY . 2008

E. Conductivity Detector

• 원 리 – 금속 도체는 다음과 같이 ohm법칙에 따른다.

R = 1 KA R = 두 전극간의 전기적 저항 A = 전극의 면적 L/A = 검출실 고유상수 K = 용액의 전도도 L = 전극사이의 거리 – 검출실내의 이온 농도가 증가하면 K값이 커지고 R값이 작아져 서 두 L/A가 일정할 때 두 전극간의 전기 전도도가 커지게 된다  BENE TECHNOLOGY . 2008

- Column -

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Column

• • • • • 여러 가지 물질을 각각의 성분으로 분리시키는 곳 재질 : Silica, Alumina, Silica-Bonded, Polymer(resin)-Bonded 입자의 크기 – 3um, 5um, 10um, 15um, 20um, 75um 입자의 형태 – Spherical, Irregular Pore 크기 : 80 A ~ 300 A  BENE TECHNOLOGY . 2008

충진재의 특성

• Pore size & Distribution – Small Pore = higher efficiency – Irregular = less band broadening • Spherical or Irregular = higher Surface area – Spherical = higher carbon load = lower pressures = better structural stability = longer life • Particle size – Smaller particle = higher operating pressure = higher efficiency  BENE TECHNOLOGY . 2008

분리기작에 따른 분류

• • • •

Normal phase Reverse phase Ion exchange Size exclusion --- a.

--- b.

--- c.

--- d.

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a. Normal Phase

• • • • Functional group의 polarity에 의한 분리 흡착작용 일반적으로 non-aqueous, non-polar solvent 사용 극성이 큰 물질이 가장 나중에 용출 Hexane polar Si-OH O Si-OH---OH  BENE TECHNOLOGY . 2008

a. Normal Phase (cont.)

• 순상충전컬럼의 종류 – – Silica Phase • YMC Pack Sil, YMC Pack Sil-6 Bonded Phase • • • YMC-Pack CN, NH2 YMC-Pack PA YMC-Pack PA  BENE TECHNOLOGY . 2008

b. Reverse Phase

• • • Bonded compound(C18, C8, CN, ph)와 분석물질간의 상호작용에 의한 분리 분배작용 비극성이 큰 물질이 가장 나중에 용출 CH 3 CN/H 2 O non-polar -Si-O-Si-C 18 -  BENE TECHNOLOGY . 2008

b. Reverse Phase 컬럼 종류

YMC Ultra HT Pro C18 YMC Ultra HT Hydrosphjere C18 YMC-Pack Pro C18 Hydrosphere C18 YMC-Pack Pro C18 RS YMC-Pack ODS-A,AM,AQ YMC-J’sphere ODS-H80,M80,L80 YMC-Pack Polymer C18  BENE TECHNOLOGY . 2008

b. Reverse Phase (cont.)

• C 18 Column 제조방법 Silica (SiO 2 ) Acid Treatment Free Silanol (Si-OH) Chemical Bonding of C 18 End-capping by TMS Element Analysis  BENE TECHNOLOGY . 2008

b. Reverse Phase (cont.)

• End-capping이란?

TMS-Cl -Si-O-Si-C 18 non-polar -Si-OH -Si-O-Si-C 18  BENE TECHNOLOGY . 2008 -Si-O-Si-C 18 non-polar -Si-O-Si-(CH 3 ) 3 -Si-O-Si-C 18

c. Ion Exchange

• • 이온화도의 차이에 의해 분리 이온교환작용 + + + + + - counter ion sample  BENE TECHNOLOGY . 2008

c. Ion Exchange (cont.)

•

컬럼 충진재의 종류

Cation Column Anion Column SO 3 NR 3 + COO  BENE TECHNOLOGY . 2008 NH 3 +

c. Ion Exchange (cont.)

• 이온교환 컬럼의 종류 – Anion/Cation – – SAX(Strong Anion Exchanger)/SCX YMC Bio pro series columns  BENE TECHNOLOGY . 2008

d. Size Exclusion

• • • 원리 – – 물리적인 분리방법, 이동 경로차에 의한 분리 큰 분자가 가장 먼저, 작은 분자가 가장 나중에 용출 충진제 – – 종류 : Styrene divinylbenzene 일정크기의 pore를 가진 충진물을 사용 응용 – – 고분자의 분자량 및 분포도를 구함.

Plastic processing 및 물성예측에 매우 중요한 정보로 사용  BENE TECHNOLOGY . 2008

d. Size Exclusion

• 분자체 컬럼의 종류 – GPC : Poly Styragel Series – – Aqueous GPC : YMC Diol 60.120.200.300.

Aqueous GFC : YMC Diol 60.120.200.300.

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컬럼의 선택

• • 화학적인 요소 (선택인자 (a), 용량인자 (k)) – 충전제의 표면성질 – 이동상의 조성 기계적 요소 (이론단수(N)) – – – 충전용기의 내경, 길이, 재질 충전제의 입자 크기 충전제의 분포상태  BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼 효율 계산(이론단수)

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컬럼의 보관 (I)

• • • 충진제와 반응하지 않는 용매로 채워서 보관.

Normal phase column -- Hexane으로 채움 Reverse phase column – 세척 후 60%~ 70% 유기 용매(CH 3 OH, MeOH)로 채움 – 장기 보관시 100% CH 3 OH, CH 3 CN로 채움  BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼의 보관 (II)

• Ion exchange column – – – – 무기 양,음이온 • • 장기간 보관 : 10% CH 3 CN 단기간 보관 : 이동상 or 5% CH 3 CN IC-pak Cation column : 2mM HNO 3 로 보관 유기 Cation column • • 장기간 보관 : 10%에탄올 단기간 보관 : 물로 채워 4도에서 보관 유기 Anion column : 물로 채워 4도에서 보관  BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼의 보관 (III)

• Size exclusion column – 지용성 GPC 컬럼 : Shipping solvent로 보관 – 수용성 GPC 컬럼 : 0.05% Sodium Azide/물 or 20% 이하의 유기용매로 보관 – 수용성 GFC 컬럼 : 0.05% Sodium Azide/물 or 20% 이하의 유기 용매로 보관  Sodium Azide는 미생물의 오염 방지  BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼의 세척 및 재생법

• • • • Normal phase column (컬럼 부피의 10배) – MeOH-Metylene Chloride-Heptane(Isooctane) Reverse phase column (컬럼 부피의 10배) – H 2 O-MeOH-H 2 O Ion Exchange column – – 무기,유기 음이온 컬럼 : 물-0.1M NaOH-물-30% 아세트산 (or 0.1N HNO 3 )–물 무기,유기 양이온 컬럼 : 물-0.1M NaOH(1~2ml)-물- 30% 아세트산 (1~2ml) Size exclusion column – 이동상으로 흘려 세척함  BENE TECHNOLOGY . 2008

- 분리능 & 이동상 -

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분리능(Resolution) R=1/4(1-1/a )SQRT(N){k`/(1+k`)}

a : 선택성 인자 N : 이론단수 (컬럼의 효율) k` : 용량인자  BENE TECHNOLOGY . 2008

이동상 – 용매의 선택 및 준비

• 용매조건 – – – – – – 물의 경우 18 mega ohm이상 Low Viscosity 용매간 섞임성 (miscibility No. 차가 15미만 ) 이동상은 고정상을 변화시키면 안됨 분리하고자 하는 시료는 이동상에 녹아야 한다 UV cutoff, Refractive index가 낮은 용매  BENE TECHNOLOGY . 2008

Buffer 용액 사용 목적

• • • 이온성 시료일 때 - 이온억제 및 이온쌍 형성 생리 활성물질의 순수 분리, 정제시 (pH조절) 이온성 물질 분리시 이온강도 조절  BENE TECHNOLOGY . 2008

이동상 변형체

• 목적 : 역상 방법에서 이온성 시료의 분리능을 높일뿐만 아 니라 시료를 비이온화시키기 위하여 사용 • 종류 – PIC A / Low UV – PIC B Series  BENE TECHNOLOGY . 2008

이동상 제조

• • • 용매 준비 – 초순수 (비저항값 ;18mega ohm) – – – 부피 대 부피 계량 계량시 volume 비로 계량 후 혼합 용매 성질에 따라 흡열 , 발열 반응 가능 >>부피비가 달라질 수 있다 Filter – 수용성 FILTER(PVDF) >> WATER로 ACTIVATION – 지용성 FILTER(PTFE) >> MeOH or 적합한 용매로 탈기 – – – – 이동상에 용존된 air, oxygen, bubble제거 Vacuum Degassing (진공탈기) >> 여과 + 탈기 Helium Sparging >> 직접 이동상에 sparging Ultrasonication (초음파 파쇄)  BENE TECHNOLOGY . 2008