Transcript Operation of HPLC

분석화학실험
7 : HPLC(High Performance
Liquid Chromatography)를 이용한
Soft Drink의 Caffeine 분석
문재연 홍진영 오수정 홍윤환
INDEX
u-GET B-PL팀 하나금융지주(인니)
Contents
- Object
- Theory
- Operation of HPLC
- Procedure
- Result
- Reference
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Object
Object
Theory
Operation
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Object
u-GET B-PL팀 하나금융지주(인
니)
- 역상(reverse phase) C18 column과 water/methanol을
이동상으로 하여 caffeine을 크로마토그래피를 이용하여
분리한 뒤 UV 검출기로 검출한다.
- caffeine 표준물질을 사용해서 검량선을 작성하고, 미지
시료의 머무름 시간(retention time)과 봉우리면적(peak
area)를 측정하여 정량한다.
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Theory
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Chromatography
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• 혼합물이 2가지 상(즉 이동상 및 고정상)의 분배에 의해
분리되는 물리적인 분리법
•
용질-용매간 상호작용
- 분산력, 쌍극자 상호작용, 수소결합, 유전 상호 작용,
쿨롱 상호 작용
→시료의 특징에 따라 통과하는 속도가 달라짐
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Chromatography 방법의 분류
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이동상
고정상
Chromatography
고정상
이동상, 고정상의 성질에 따라 분류
Result
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
정지상에 따른 분류
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비교 항목
정상
역상
고정상 극성 정도
극성
C18비극성
column
이동상 극성 정도
비극성
시료의 용리 순서
극성 소 → 대
극성 대
대→
극성
→소소
소요되는 분석 시간
(용매의 극성의
증가에 따라)
짧은 분석 시간
긴 분석시간
대상 시료
극성시료
비극성시료
Caffeine
극성
water/methanol
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
HPLC (high-performance liquid chromatography)
• 정지상과 이동상 사이에서 평형을 이루는 속도를 칼럼,
충전제, 장치의 개선을 통해 증가시킴
•
보통의 LC에서 입자를 더욱 작게 하고, 가는 분리관과
고압펌프를 사용하여 용매를 흘림
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Plate Height
- Chromatography Column 효율의 척도
• Plate Height(단높이), H
-띠의 가변도(σ2)와 띠가 이동한 거리(x) 사이의 비례상수
𝐇 = σ2/x
-단높이가 작을수록 띠너비는 더 좁아진다.
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Van Deemter Equation
• Van Deemter Equation
:칼럼과 유속이 단높이에 어떻게 영향을 끼치는지 설명
𝒖 = 선형 유속
𝑩
𝐇 = 𝐀 + + 𝑪𝒖
𝒖
A,B,C – 칼럼과 정지상에 대한 상수
A = 다통로(multiple path) : 이동상, 고정상에서의 다중경로 , eddy diffusion
B = 세로 확산(longitudial diffusion) : 띠 중심으로부터 칼럼의 축을 따라 일어
나는 확산
C = 질량이동(mass transfer) : 용질이 이동상과 정지상 사이에서 평형을 이루
는데 소요되는 일정 평형 시간
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
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Object
Theory
Operation of HPLC
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Operation of HPLC
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Procedure
Result
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Eluent
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니)
• 용매, 용리액
• 이번 실험 → 메탄올:물 = 6:4
• Degassing
: 용매 내에 녹아 있는 가스 제거
– 기포 유입 방지하여 pumping의 정밀
성을 향상시키고 재현성있는 결과 획
득,
시료 또는 이동상이나 고정상과 반응할
수 있는 기체 제거(산소),
형광검출기의 경우 background값을 크
게 하는 현상 방지
Object
Theory
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Procedure
Result
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Pump
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• 용매 저장 용기에서 용매를 흡
입하여 시료 주입기에서 검출
기에 이르는 전 기기 부분에
밀어 주는 역할
• 주의할 점
:호스 내의 가스를 제거한 후
에 용매 주입
(pump의 PRIME/PURGE valve
이용)
Object
Theory
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Procedure
Result
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Injector
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• 분석하고자 하는 물질을 시스템중
의 용매의 흐름에 연결시키는 역할
• injector 사용 이유
-일정하고 정확한 양의 분석물질을
주입하기 위해
-높은 압력을 일정하게 유지하기 위
해
Object
Theory
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Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Injector
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syringe
Load
Inject
Solution of excess amount
20μL씩
일정하게 주입
Column
Solvent
Object
Theory
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Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
시료 주입 방법
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• Syringe를 이용하여 시료를 취하는
데 이때 기포가 들어가지 않게 하는
것이 중요
(분석 결과에 영향을 미치기 때문에)
• Injector에 의해 일정하게 주입되기
때문에 과량을 취해도 상관 없음
• 시료를 취한 후 매번 메탄올로 씻기
Object
Theory
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Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
시료 주입 방법
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니)
1. Inject 상태에서 Syringe를 홀에 넣
어준다.
2. 레버를 돌려 Load 상태로 전환 후
피스톤을 밀어서 시료를 주입시킨
다.
3. 레버를 다시 Inject 상태로 돌리면
서 동시에 프로그램의 피스톤 모양
(
)을 클릭한다. (분석 시작)
4. 이 후 syringe를 뺀 후 메탄올로 세
척하고 시료 분석이 완료될 때 까지
기다린다.
Object
Theory
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Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Column
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• 관 모양의 용기에 충진제가 채워
진 형태로 되어 있으며, 충진물,
시료, 용매의 상호 작용에 의해 혼
합물 속의 분석 대상 물질을 분리
하는 역할
• Reverse C18 column
Silica
particle
비극성
CH3
|
Si―O―Si―(CH2)17CH3
|
CH3
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
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Detector
u-GET B-PL팀 하나금융지주(인
니)
• 분석 대상 물질을 시간 간격에 따
라 기기적으로 인지하여 전기적
신호로 바꾸어 주는 장치
• 시료의 양과 신호의 크기의 관계
에 따라 시료를 정량
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
UV Detector
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니)
Eluate
• Beer’s Law
A=abC
Light
Detector
source
A : Absorbance
a : Absorbance coefficient
b : Path length
C : Concentration of analyte
275nm
파장
Eluent
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Recorder
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• 검출기에서 나오는 전기적 신호를
시간에 대한 신호의 크기로 받아
크로마토그램을 작성
Object
Theory
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Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
HPLC 프로그램 사용법
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• 기기를 켜고 설정을 실험에 맞게 설정한다.
• 멀티크로 2000을 컴퓨터에서 실행한다.
• 목록 중 빈 병 표시가 된 것을 선택한다.
•
버튼을 눌러 영점을 맞춘다.
•
run 버튼을 누른다
• 시료를 주입한다.
•
버튼을 누르면 분석이 시작된다.
• 분석이 다 될 때 까지 기다린 후 다 되면 정지 버튼을 누른다.
→ 학기 중에 Autochro2000 프로그램으로 바뀌었으므로 자신이 사용
한 프로그램을 잘 숙지하시면 됩니다.
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Procedure
Object
Theory
Operation of HPLC
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Caffeine(카페인)
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니)
- C8H10N4O2
- MW : 194.19 g/mol
- 녹는점 : 238℃
Procedure
Result
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
A) 카페인 표준물의 Chromatogram
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1.
MeOH/water (60/40 (v/v))을 5분간 용액으로부터 가스를 제
거한다.
-기포가 HPLC에 들어가면 분석 결과에 영향을 준다.
2.
펌프와 검출기를 작동시킨다.
- 펌프의 흐름속도 : 1.0mL/min
- 검출기의 세기 : 0.02 AUFS
(absorbance units full scale)로
조절
- 파장 : 275nm
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
A) 카페인 표준물의 Chromatogram
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3. 이동상 MeOH/water (60/40 (v/v))을 5~10분간 분리관 속으
로 흘려준다.
(이동상이 column 내를 채우기를 기다린다.)
4. 카페인 1000ppm 용액을 MeOH/
water (60/40 (v/v))을 사용해서
25ppm, 50ppm, 75ppm, 100ppm
으로 묽힌다.
5. 가장 옅은 농도의 표준물질 25ppm
을 20μL를 취하여 HPLC안에
주입한다.
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
A) 카페인 표준물의 Chromatogram
u-GET B-PL팀 하나금융지주(인니)
6. 크로마토그램을 기록하고, 3회 반복 측정한다.
-크로마토그램을 적분한 뒤 retention time과 peak area를
노트에 기록한다.
7. 카페인 표준물질 50ppm, 75ppm, 100ppm에 대해서도 위
과정을 반복하여 검정선을 작성한다.
Object
Theory
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HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
B) 음료 속의 카페인 분석
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니)
1. 분석하고자 하는 음료수를
준비한다.
2. 탄산이 포함된 음료수의
경우, sonicator에서 기체를
제거해준다.
Procedure
Result
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
B) 음료 속의 카페인 분석
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3. syringe filter를 이용하여
시료 내 불순물들을 제거한
다.
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
B) 음료 속의 카페인 분석
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4. A) 과정과 동일하게 20μL를 취하여 HPLC에 주입하고, 크로
마토그램을 기록한다.
-카페인의 peak area가 A) 과정의 dynamic range를 벗어나
는 경우, 적절하게 더 희석시킨 후, 다시 크로마토그램을 기
록한다.
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
C) 미지시료 분석
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1.
준비된 (조교만 카페인농도를 알고 있는) 미지시료를 A)과정
과 동일하게 20μl를 취하여 주입하고, 크로마토그램을 기록
한다.
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
주의사항
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니)
1.
이동상인 MeOH/water (60/40 (v/v)) 용액으로부터 가스를
제거한다.
2.
HPLC에 주입하는 표준물질에 가스가 없도록 한다.
3.
음료의 크로마토그램 결과가 dynamic range를 벗어나는 경
우 묽힌 후 다시 실험한다.
4.
표준물을 주입할 때 레버를 inject 상태로 돌리면서 동시에
분석 시작 버튼을 눌러야 한다.
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
RESULT
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
A) 카페인 표준물의 Chromatogram
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Result
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
A) 카페인 표준물의 Chromatogram
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Result
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
A) 카페인 표준물의 Chromatogram
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Retention Time (min)
25ppm
50ppm
75ppm
100ppm
1
5.500
5.450
5.450
5.450
2
5.433
5.417
5.467
5.417
3
5.450
5.433
5.450
5.417
Average
5.461
5.433
5.456
5.428
Stdev.
0.034828
0.016503
0.009815
0.019053
Peak Area
25ppm
50ppm
75ppm
100ppm
1
67334.08
139548.55
171991.75
235978.88
2
71086.18
134208.05
181040.3
280387.1
3
60671.15
131874.08
189580.88
291264.92
Average
66363.80
135210.23
180870.98
269210.30
Stdev.
5274.87
3934.16
8795.79
29288.69
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
A) 카페인 표준물의 Chromatogram
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Result
Object
Theory
Operation of HPLC
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
B) 음료 속의 카페인 분석
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니)
Procedure
Result
Object
Theory
Operation of HPLC
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
B) 음료 속의 카페인 분석
u-GET B-PL팀 하나금융지주(인
니)
Procedure
Result
Object
Theory
Operation of HPLC
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
B) 음료 속의 카페인 분석
u-GET B-PL팀 하나금융지주(인니)
Procedure
Result
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
B) 음료 속의 카페인 분석
u-GET B-PL팀 하나금융지주(인
니)
 펩시에 들어있는 카페인의 농도 =111.98ppm
Result
Object
Theory
Operation of HPLC
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
B) 음료 속의 카페인 분석
u-GET B-PL팀 하나금융지주(인니)
Procedure
Result
Object
Theory
Operation of HPLC
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
B) 음료 속의 카페인 분석
u-GET B-PL팀 하나금융지주(인니)
Procedure
Result
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
B) 음료 속의 카페인 분석
u-GET B-PL팀 하나금융지주(인니)
 비타500에 들어있는 카페인의 농도 = 약 9.26ppm
Object
Theory
Operation of HPLC
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
B) 음료 속의 카페인 분석
u-GET B-PL팀 하나금융지주(인
니)
Procedure
Result
Object
Theory
Operation of HPLC
Procedure
Result
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
토의 및 고찰
u-GET B-PL팀 하나금융지주(인니)
1.
표준물을 취해 HPLC에 주입할 때, 기체가 완전히 제거되지
않았을 수 있다.
2.
음료 용액을 희석 할 때, 정확히 ½배 희석되지 않았을 수 있
다.
3.
Syringe를 메탄올 용액으로 세척하는 과정에서 완전히 세척
되지 않았을 수 있다.
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Reference
1.
분석화학실험, 연세대학교 이과대학 화학과
2.
Daniel C. Harris, Quantitative chemical anaysis, W.H.
Freeman and Company, 7th edition.
3.
박기채, 기기분석의 이해, CengageLearning
4.
Center for Science in the Public Interest, 2007
HPLC를 이용한 Soft Drink의 Caffeine 분석
Thank you
Q&A