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Métabolisme de l'arsenic:
aspect physiologique et
phylogénétique
Simon Duval
Sous la direction de Barbara Schoepp-Cothenet
BIP09 équipe « d’évolution des chaînes de transferts d’électron
procaryote » dirigé par W. Nitschke
Historique de
l’arsenic
• Albertus Magnus isola l’élément arsenic en 1250
•Les minéraux arséniés sont utilisés depuis l’Âge du Bronze et
étudiés depuis l’Antiquité
• Dès le quatrième millénaire avant JC, les historiens constatent
que le Bronze est souvent composé d’un alliage à base de cuivre et
d’arsenic
Historique
• À l’époque romaine l’extraction de l’or à partir d’orpiment
Lors de la fonte des minerais métallifères pour extraire les
métaux, l’arsenic est oxydé en oxyde d’arsenic (As2O3) 
paralysie de certains membres (ex:dieu du feu Hephaistos)
• Civilisations akkadiennes, égyptiennes, et grecques dans des
préparations colorantes pour la peinture, la cosmétique et
l’écriture Ces minerais furent encore employés par les
peintres de la Renaissance
Historique
Arsenic médicament ou poison ?
Médicament !!!
La toxicité de l’arsenic: très tôt utilisé comme agent thérapeutique
ex: Assyriens (2000 avant JC)
Hippocrate (400avant JC) pour traiter les ulcères
L’Antiquité comme remèdes contre le flegme,
l’empoisonnement, la peur des fantômes et la lèpre
Alchimistes arabes (~700 après JC) traitements de l’asthme, des
maladies des poumons, de la peau, et de la dysenterie et les
premiers à l'employer contre la peste
Moyen Âge, produits à base d’arsenic sont disponibles chez tous
les apothicaires
Historique
Arsenic médicament ou poison ?
Médicament !!!
Au
èmeunsiècle,
le médecin
Paracelsus
(1493-1541),
prescrivait de
En 16
1786,
pharmacien
anglais,
Thomas
Fowler : utilisa
l'arsenic
pour
le traitement
tumeursde fièvres intermittentes.
arsénite de
sodium,
pour le des
traitement
«toute
substance
poison,
n’y enutilisée
a aucune
ne soit un
La solution
dite« est
de un
Fowler»
futil alors
pourqui
traiter
poison.
Lel’asthme,
dosage correct
différencie
le poison et
dul’eczéma
remède
l’anémie,
le psoriasis,
le pemphigus,
Historique
Arsenic médicament ou poison ?
Médicament !!!
Au début du 20 ème siècle, Paul Ehrlich (prix Nobel de
médecine1908) découvrit le 4,4-arsenobis
dihydrochloride encore dénommé arsphenamine plus
connu sous le nom de salvarsan (pendant quarante ans
le médicament de référence pour traiter la syphilis
avant d’être remplacé par la pénicilline).
Les composés à base d’arsenic ensuite remplacés par des produits
moins dangereux. Aujourd’hui encore utilisé comme anticancéreux
Historique
Arsenic médicament ou poison ?
Poison !!!
Facile à se procurer, sans odeur ni goût, et les symptômes sont
proches de ceux de maladies connues
A l’Antiquité, certains textes montrent que les symptômes dus
aux empoisonnement provenait de l'arsenic
L’âge d’or des empoisonnements à l’arsenic se situe entre
la fin du Moyen Âge et la première moitié du 19 ème siècle.
Historique
Arsenic médicament ou poison ?
Poison !!!
L’arsenic a été employé comme arme de guerre.
Les anciens Chinois préconisaient de brûler les sulfures d’arsenic
pour produire les fumées toxiques afin d’empoisonner l’armée
ennemie.
Ce type d’arme préfigurait les gaz de combat à base d’arsenic
(adamsite et léwisite) utilisés au cours de la première guerre
mondiale
Actuellement
Agriculture: Pesticides, herbicides, fongicides, insecticides,
raticides, défoliants, conservation du bois
Élevage: Alimentations additives, prévention de maladies
(Dysenterie porcine)
Médecine: traitement antisyphilitiques, trypanosomiase,
amibiase, anti-cancéreux
Électronique: Cellules solaires, semi-conducteur
Métallurgie :durcissement des métaux autres
électrophotographies, catalyses, pyrotechnies, céramiques,
verreries
Arsenic
Arsenic
- Arsenic (As) présent sous 3 formes:
Toxicité
Arsine (As III-)
Arsénite (As III +)
Arséniate (As V+)
+
-
- Arsenic  graves maladies
hyperkératose
Arsenic
- Arsenic (As) présent sous 3 formes:
Toxicité
Arsine (As III-)
Arsénite (As III +)
Arséniate (As V+)
+
-
Cancer de la peau
Arsenic
- La principale voie d’absorption (95% des cas) de l’arsenic
chez l’homme est la voie orale: 2/3 par ingestion et 1/3 par
inhalation
Arsenic
- Le nombre de personnes exposées à l’arsenic a conduit l’OMS
à s’intéresser de prés à ce problème
Arsenic
- Les microorganismes sont les principaux responsables de la
transformation (par méthylation, réduction ou oxydation) de
l’arsenic:
1)Arsénite oxydase
2)Arséniates réductases
Métabolisme de l’arsenic
AsO43-
As(OH)3
ArrA
AsoA
ArrB
Canal à H2PO4-
AsoB
pompe
réductase
Plan
1ère partie: caractérisation de l'arsénite oxydase
• 1) Etude des potentiels de l'arsénite oxydase par RPE
• 2) Etude du partenaire physiologique
2ème partie: évolution de l'arsenic au cours du temps
• Phylogénie de l'arsénite oxydase
• Phylogénie des arséniates réductases
Partie 1: caractérisation de l’arsénite oxydase
Arsénite oxydase
- Connue chez de nombreux organismes (chemioautotrophes
et hétérotrophes)
- Gènes d'arsénite oxydase présents
aussi bien chez les bactéries que
chez des archées
AsoA
AsoB
Arsénite oxydase
2 sous unités:
- Petite de 14kDa (2Fe-2S):
AroB
- Grande de 88kDa (Mo et
3Fe-4S): porte le site
catalytique: AroA
Transfert électronique proposé chez
Alcaligenes faecalis (voltamétrie cyclique)
- Potentiels d ’oxydoréductions
ne sont pas favorables
0
AsIII/ AsV
100
200
300
- Molybdène peut transférer 2
[2Fe-2S] électrons alors que les centres
[3Fe-4S], [2Fe-2S] et cytochrome c
ne peuvent en transférer qu’un
[3Fe-4S]
Mo
cyt c ou azurine
 Potentiels sont-ils spécifiques de cette bactérie?
1) Etude des potentiels d ’oxydoréductions
des centres [Fe-S] par RPE
- Etude des signaux des centres paramagnétiques (Fe, S,
Cu ou Mo) par application d'une onde électromagnétique
dans un champs B
E = +1/2 g βB
h ν = gβB
B= 0
B croissant
E = -1/2 g βB
 Signal spécifique à un type de centre et à son environnement
Etude des potentiels d ’oxydoréductions
des centres [Fe-S] par RPE
Signaux RPE des centres [3Fe-4S] et [2Fe-2S] de
l'Arsénite oxydase
m68
m57
m41
m40
m27
m10
p4
p30
p50
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
3600
3800
g (Gauss)
ERP signal at g = 1.88
Titrage RPE du centre [2Fe-2S] chez 2 protéobactéries
10
EmpH6 = +210 + 10 mV
8
6
4
2
0
100
150
200
250
Potential (mV)
 Em6 du centre [2Fe-2S] estimé à +210 + 10 mV
300
Titrage RPE du centre [3Fe-4S]
p290b
p290a
p336a
p336b
p336c
p336d
3300
3350
3400
3450
L’état du centre [3Fe-4S]
n’est pas stable, même à
70 K
3500
Gauss
 Hyp: le centre [3Fe-4S] serait en interaction électronique avec
le centre Molybdène dont l’état V est stable
Inhibition de l'arsénite oxydase par le sulfite
100
10 µM
80
60
1/v
5 µM
0 µM
40
20
0
0
500
1500
1000
2000
-1
1/[S] µM
 Le sulfite (Ki = 5-10 µM) est un inhibiteur compétitif de l'arsénite
oxydase
Titrage RPE du centre [3Fe-4S] en présence de sulfite
g = 1.99
Sans sulfite
8
m12
m25
m54
m74
p0
p31
p50
p52
p70
p83
p93
p103
p117
p131
p146
p160
p181
7
6
EmpH6 = +270 mV + 10mV
EPR signal
5
4
3
2
1
3280 3290 3300 3310 3320 3330 3340 3350 3360 3370 3380 3390 3400
Gauss
0
-1
150
200
250
300
potential (mV)
 Em6 du centre [3Fe-4S] estimé à +270 + 10 mV
350
400
Recherche du centre Molybdène V
Aucun signal de Molybdène V trouvé à 55 K:
• Sans sulfite
• Avec sulfite
 Hyp: signal trop faible, et donc les conditions ne sont pas
optimales pour voir le Molybdène V
Conclusions
• Détermination des potentiels des centres [3Fe-4S] et [2Fe-2S]
Em6 2Fe-2S = 210mV + 10 mV
Em6 3Fe-4S = 270mV + 10 mV
 Potentiels toujours pas favorables
• Interaction électronique entre le centre [3Fe-4S] et le centre
Molybdène
• Pas de signal du centre Molybdène V mais existence d’un état
V stable
 Le molybdène transfert donc un électron à la fois au centre
[3Fe-4S]
2) Etude de l'accepteur
d'électron de l'arsénite oxydase
L'accepteur d'électron de l'arsénite oxydase chez Alcaligenes
faecalis est une azurine ou un cytochrome c soluble
Chez NT-26 il existe un cytochrome c552 capable d'accepter
les électrons de l'arsénite oxydase et qui est homologue au
cytochrome de cœur de cheval
Chez NT-14 le cytochrome de cœur de cheval ne fonctionne pas
avec l'arsénite oxydase
Etude d'activité chez NT-26 et S22
Cyt c552
de S22
Cyt Cœur de
cheval c550
Cyt c555
DCPIP
S22
+++
-
++
++
NT-26
-
+++
-
+
 La même enzyme ne fonctionne pas avec les même
accepteurs chez des bactéries de même famille
Comparaison des structures des cytochromes
Bleu: cyt de S22
Charge globale des cytochromes est la même
Gris: cyt de cœur de
cheval
Chez le cytochrome de cœur de cheval il existe une boucle
supplémentaire  interaction avec l'arsénite oxydase
différente
Conclusions
Il existe 2 types de cytochromes:
• Fonctionnent avec l'arsénite oxydase de S22 et qui ne possèdent
pas la boucle supplémentaire
•Fonctionnent avec l'arsénite oxydase de NT-26 et qui possèdent la
boucle supplémentaire
 2 types d'arsénite oxydase, une du type S22 et l'autre de
type NT-26
Perspectives
Etude des propriétés physico-chimique de chaque type
d'arsénite oxydase : effet de la température, du pH, stabilité,
Km, Vm
Etude des zones d' interactions arsénite oxydase - cytochrome
par RPE
Etude structurale des 2 types d'arsénites oxydases
Partie 2: Evolution de l'arsenic
au cours du temps
L’arséniate réductase
Arséniate réductase
Cette réduction se fait à l'aide des produits des gènes ars ou arr
Les systèmes sont présents chez de nombreux organismes:
bactéries, archées et levures
Il existe 2 types d'arséniates réductases:
-Arséniate réductase respiratoire
-Arséniate réductase détoxifiante
Arséniate réductase respiratoire
AsO43-
ArrA
As(OH)3
ArrB
Dans ce cas l’arséniate réductase est en fin de chaîne respiratoire
Arséniate réductase respiratoire
C'est une Molybdoenzyme
Elle possède 2 sous unités:
ArrA : sous unité catalytique
ArrB : transfère les électrons
(ArrC: ancre membranaire)
4x[4Fe-4S]
29 kDa
ArrB
[4Fe-4S]
95 kDa
ArrA
arrC
arrA
arrB
Arséniate réductase détoxifiante
Canal à H2PO4-
pompe
réductase
Dans ce cas l’arséniate réductase participe à une simple
détoxification
Arséniate réductase de type arsC
C'est la famille la plus étudiée
Son activité est dépendante du glutathion et de la
glutaredoxine
Le modèle est l'arsC du plasmide R773 de E.coli
régulateur
pompe
site catalytique
Arséniate réductase de type arsC
monomère
Arséniate réductase de type pI258
Son activité est dépendante de la thiorédoxine
Elle est proche des LMWP tyrosine phosphatase
Le modèle est le plasmide pI258 de Staphylococcus aureus
Arséniate réductase de type pI258
monomère
Arséniate réductase de type Acr2p
Son activité est dépendante du glutathion et de la
glutaredoxine
Elle est proche des protéines de type tyrosine phosphatase
notamment de CDC25
Le modèle est Saccharomyces cerevisiae
acr1
acr2
acr3
régulateur site catalytique
pompe
Arséniate réductase de type Acr2p
CDC25
Résumé des différentes arséniates réductases
- Arséniate réductase respiratoire
- Arséniate réductase détoxifiante:
1) de type arsC (type E.coli)
2) de type pI258 (type S.aureus)
3) de type acr2p (type S.cerevisiae)
Arsenic au cours de l'évolution
- Comment ont évolué les enzymes au cours de l'évolution ?
- L'influence de l'apparition de l'oxygène sur l'utilisation de
l'arsenic par les microorganismes
Biosphère primordiale
Atmosphere actuelle
High state
Ozone
?
LUCA
Océan
Arséniate
Arsénite
Low state
? O2 ?
Divergence
Archae/Eubactéries
Cyanobactéries
Photosynthèse oxygénique
Phylogénie
Etude des relations d'évolution entre organismes en comparant:
• critères morphologiques
• séquences protéiques, d'ADN ou d'ARN
Arbre phylogénétique: illustration d'évolution entre les organismes
d'un groupe
ex: arbre phylogénétique universel basé sur les séquences ARN 16S
Arbre phylogénétique basé sur l'ARN 16S
Branche
Noeud
I. Arsénite oxydase
Lebrun et al,2003
 arsénite oxydase, une enzyme ancienne
II. Arséniate réductase respiratoire
Un Blast nous montre que les gènes arr sont proches des
gènes psr
 étude globale psr-arr
Critères d'organisations:
Arr
arrC
arrA
arrB
Psr
psrA
psrB
psrC
Arséniate réductase respiratoire
Bactéries
NarG Staau
ArrA
MLMS
ArrA2
Alk eh
NarG Bacli
ArrA Alkeh
DMSOA
Haein
DMSOA
Ecoli
NarG Eshco
NarG Psest
DMSOA Actsu
1000
1000
994
1000
469
418
178
429
613
982
859
995
1000
1000
ArrA
Desha
ArrA
Wolsu
ArrA Sulba
ArrA Bacar
ArrA Bacse
ArrA Chrar
ArrA Geolo
1000
1000
NapA Pseae
ArrA Shean
ArrA Closp
ArrA Alkme
Arseniate
réductase
Archées
PsrA Arcfu
NapA Psest
1000
509
806
990
NapA Desvi
607
508
203
341
557
508
995
881
1000
PsrA Pyrae
1000
560
FdhH Eshco
ArrA2 Halha
997
PsrA Desde
1000
Archées
Wolsu
PsrAPsrA
Camcu
PsrA MLMS
PsrA Carhy
PsrA Geolo
PsrA Shean
PsrA Salen
SulTo AO
553
337
998
996
ChlFl AO
AerPe AO
1000
969
ChlLi AO
NT-26 AO
678
ChlPh AO
TheTh AO HerAr AO
Arsenite oxydase
Bactéries
850
Thiomonas AO
AlcFa AO
Polysulfide
reductase
Arséniate réductase respiratoire
- Psr et arr de la même famille
- Psr ancien apparu avant la séparation archées / bactéries
- Organisation dans l’arbre des arr chaotique  transfert
latéral intense
 Psr serait l’ancêtre des arr
III. Arséniate réductase dissimilatrice
}
Type
pI258
}
Type
arsC
Type
acr2p
 Les 3 familles d'arséniate réductases ont évolué indépendamment
et résultent d'une évolution convergente
Organisation opéronique
S.Aureus pI258
arsR
E.Coli R773
arsR
S.cerevisiae
acr1
arsB
arsC
arsA
arsD
acr2
R.metallidurens
arsR
arsC
Ma.magneticum
arsR
arsC
C.acetobutylicum
arsR
acr3
arsB
arsC
acr3
acr3
arsC
acr3
arsC
arsD
arsC
 Nous avons seulement pris les opérons possédant au
minimum arsR, une pompe et arsC
arsR
+
Pompe
+
réductase
Le site catalytique ars C
}
Type
pI258
}
Type
arsC
Type
acr2p
 Bon alignement au sein de chaque famille mais pas entre elles
Comparaison des 3 types d’arséniates réductases
R773
pI258
A
B
C
CDC25
 La structure est très conservée au site actif et à proximité
de celui-ci dans les 3 types
Arbre des arsC
Kluyveromyces Lactis
976
Saccharomyces cerevisiae
Haemophilus influenzae
974 Rhodopseudomonas palustris
423
Escherichia coli
647
Erwinia carotovora
757
Yersinia frederiksenii
Corynebacterium gene 1
Desulfuromonas
acetoxidans
404
Corynebacterium gene 2
Methanospirullum hungatei
947
Deinococcus geothermalis
369
Desulfitobacterium hafniense
94 Geobacillus kaustophilus
230Bacillus subtillis
94
535
Staphylococcus aureus
255 Staphylococcus saprophyticus
331Bacillus cereus
233 644
Bacillus anthracis
Lactobacillus johnsonii
Blastopirellula marina
643
Chlorobium tepidum
224
953Chlorobium phaeobacteroides
394 Chlorobium ferrooxidans
699
297
Bacteroides thetaiotaomicron
Prosthecochloris aestuarii
Thiobacillus denitrificans
228
Shewanella oneidensis
379
Thiomicrospira denitrificans
314
802
Wolinella succinogenes
Magnetospirullum magnetotacticum MS1
360 323 952Burkholdheria sp.
Burkholderia cep arsC
Pseudomonas sy
531 864945Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas aeruginosas
Ralstonia metallidurens
Shigella flexneri
238349
924 Herminiimonas arsenicoxidans gene 1
933 Herminiimonas arsenicoxidans gene 2
Azotobacter vinelandii
755
Herminiimonas arsenicoxidans gene 3
996
Acidovorax sp
363 Rubrivirax gelatinosus
707
Magnetospirullum magneticum AMB1
473 Sinorhizobium medicae
432 Cauobacterl sp.
585 Bradyrhizobium japonicum
Mesorhizobium sp.
754
669Xanthobacter
sp
Rhodopseudomonas palustris gene 1
311Nitrobacter winogradskyi
558
Rhodopseudomonas palustris gene 2
Type acr2p
Type arsC
676
676
Type
pI258
0.1
 Les 3 familles sont indépendantes dans l'arbre
Hypothèses
Les structures au niveau du site actif sont très proches
Les 3 familles sont indépendantes dans l'arbre
Il manque la séquence des ancêtres communs
PTP
Type ars C
Type pI258
Type acr2p
CDC25
IV. Les pompes à arsénite
Il existe 2 types de pompes à arsénite:
-Une pompe ArsB
-Une pompe Acr3
Les 2 types de pompes ArsB et Acr3 sont sans homologie de
séquences
La pompe ArsB est apparue la première phylogéniquement
La pompe Acr3 n’est présente que chez la levure et apparue
tardivement
Les pompes à arsénite sont-elles très différentes?
 Les 2 pompes à arsenic sont en fait assez proches
La comparaison de séquences n’est pas convaincante
Pompes de structures proches
Residues (n°)
1
18 25
42
56
72 76
7
26
37
65
110
148
178
221
265
arsB pump
76
84
103
115
135
150
175
acr3 pump
 La structure est globalement conservée
210
237
2 pompes distinctes
ArsB
Acr3
Archées
Meth hungatei
565
Met mazei
Sin med
Stap auUSA300
591
delta pro
1000
298
Firmicutes
Stap auN315
Lac john
Clo ace
414
809
Des haf
1000
633
Bac sub
966
992
890
Stap sap
Bac cer
Firmicutes
993
Bac anth
Pro aes
1000
965
1000
Chlo phae
924
Thio den
Chlo fer
454
Chlo tep
1000
Cor eff
634
1000
Wol succ
1000
Cor glub
Caul sp
Dei geo
Déinoccocale
535 963
Rho palBisB18
747
Rho palCGA009
964
890
Xan au
427
925
Nit win
E coli
Brad jap
433
984
Mag magMS1a
1000
Mag magMS1b
1000
560
Yer fre
Mag magAMB-1
1000
Ral met
Thio den
572
Erw car
517
Shi flexa
1000
Shi flexb
TRICHOTOM Y
Actinobactéries
Meso sp
907
482
Cor gluaCorynebacterium
Pseu fluo
Protéobactéries
Met pet
893
671
Acido spb
704
Bur sp
Azo vin
938
Acido spaAcidovorax
900
Her arsa
Pseu aer
1000
Her arsb
0.1
Her arsb
0.1
 Acr3 est plus fréquente que la pompe ArsB
 Acr3 est plus ancienne que la pompe ArsB
Protéobactéries
•Arsénite oxydase
•Pompe à arsénite Acr3
•Pompe à asIII Système ars
•As réductase
•PTP
•Polysulfide reductase
Atmosphere
actuelle
Arsénite
High state
•Arr
Arséniate
Ozone
Low state
LUCA
Océan
? O2 ?
Divergence
Archae/Eubactéries
Cyanobactéries
Photosynthèse oxygénique
Conclusion
AVANT APPARITION D'O2
- Arsenic présent sous sa forme réduite (arsénite)  bactéries
doivent se protéger de l'arsénite
• utilise l'arsénite  arsénite oxydase
• élimine l'arsénite  pompe à arsénite de type acr3
- D'autres éléments présent qui peuvent être utilisé par les
bactéries
• utilise le sulfite  polysulfite réductase
• utilise le phosphate  protéine tyrosine phosphatase
Conclusion
APRES APPARITION D'O2
- Arsenic est sous sa forme oxydé (arséniate)  bactéries
doivent se protéger de l'arséniate
• utilise l'arséniate  arséniate réductase respiratoire (arr)
• élimine l'arséniate  arséniate réductase détoxifiante
(système ars)
- Arséniate réductase respiratoire apparaît à partir de mutation
de la polysulfide réductase
- Arséniate réductase détoxifiante formée, à partir d'une pompe
à arsénite ancienne (acr3) ou apparues lors de l'apparition de
l'O2 (arsB), et d'une arséniate réductase arsC provenant d'une
protéine tyrosine phosphatase
Conclusion générale
- Etude RPE d'une protéine possédant des centres [Fe-S]
- Etude enzymologique d'une enzyme avec calcul d'une constante
d'inhibition
- Etude structurale des cytochromes fonctionnant avec
l'arsénite oxydase
- Etude bio informatique de gènes impliqués dans la transformation
de l'arsenic
- Etude phylogénétique ayant permis d'établir une théorie sur
l'utilisation de l'arsenic par les microorganismes au cours de
l'évolution
Merci de votre attention
Questions ???