GENÓMICA FUNCIONAL Estudio de la expresión de genomas completos Análisis de Proteomas ¿Cómo abordamos el estudio y comprensión de un sistema biológico? Nivel de complejidad Nivel de.
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GENÓMICA FUNCIONAL Estudio de la expresión de genomas completos Análisis de Proteomas ¿Cómo abordamos el estudio y comprensión de un sistema biológico? Nivel de complejidad Nivel de detalle Motivo del análisis Tipo de pregunta Genoma Representación estática de un sistema biológico Todo lo que puedo leer Ninguna célula lee todo el genoma a la vez Transcriptoma Representación de la expresión génica en un estado fisiológico determinado Tipo celular, estados fisiopatológicos Qué genes se leen Proteoma Visión integrada de las proteínas en un proceso biológico Integra más información Estado,localización, interacción, cantidad A partir de la secuencia del DNA no se puede predecir: 1. Si y cuándo un RNA se traduce. 2. La concentración relativa de productos génicos. 3. Modificaciones postraduccionales. 4. Represiones y sobreexpresiones génicas. 5. Fenotipos resultantes de la actuación de múltiples genes. Proteómica • El análisis del transcriptoma (mRNA) permite el estudio y la caracterización de enfermedades, la predicción de reacciones a medicamentos o a cambios en el ambiente. • Las moléculas funcionales en una célula no son los mRNAs, sino las proteínas. Un transcrito no siempre corresponde con la proteína relevante, la síntesis de proteínas es regulada independientemente. Proteómica • El término proteómica fue sugerido por primera vez en 1995. • Representa el estudio de todas las proteínas presentes en una célula, tejido u organismo entero. • En un organismo superior cada gen da lugar a la producción de 10 proteínas en promedio. • Cómo se expresan las proteínas, cómo funcionan y cómo interactúan. La proteómica plantea objetivos complementarios • Sistemático: estudio global de la expresión proteica, es decir, identificación de todas las proteínas en referencia a un estado fisiológico determinado. • Pragmático: propone comparar la expresión proteica de dos situaciones fisiológicas y establecer mapas bidimensionales. Aplicación 1. Sistemático. Analizar: • • • • Modificaciones postraduccionales. Localización subcelular. Interacción con otras moléculas. Estado fisiológico de la toma de muestra. 2. Pragmático. Estudios de expresión diferencial de proteínas en diferentes estados fisiológicos: • Medicina. • Toxicología. • Farmacología. ¿Cómo se caracteriza una mezcla proteica? 1. SEPARAR LAS PROTEÍNAS • Preparar la muestra • Técnicas de separación: Cromatografía Electroforesis 2D 2. MEDIR ALGUNA PROPIEDAD INTRÍNSECA • Masa, espectrometría de masas 3. COMPARACIÓN CON BASES DE DATOS • PMF = Peptide Mass Fingerprinting Técnicas usadas para caracterizar proteínas Análisis de Proteomas Separación de Proteínas Isoelectroenfoque Electroforesis de segunda dimensión Isoelectroenfoque Una solucion de anfolitos es incorporada en un gel Se genera un gradiente estable de pH tras la aplicación de un campo eléctrico Se añade una solución con proteínas y se reaplica un campo eléctrico Tras la tinción, las proteínas aparecen distribuidas a lo largo del gradiente de pH de acuerdo con su valores de pI Isoelectroenfoque Separación de proteínas por sus cargas intrínsecas. Muestra disuelta en pequeño volumen de una solución con detergente no iónico (sin carga), junto con bmercaptoetanol y el agente desnaturalizante urea. Isoelectroenfoque La solución solubiliza, desnaturaliza y disocia todas las cadenas polipeptídicas pero no cambia la carga intrínseca. La carga neta de una proteína varia con el pH de la solución que la rodea. Isoelectroenfoque Cada proteína tiene un punto isoeléctrico característico, el pH al cual la proteína no tiene carga neta y por lo tanto no migra en un campo eléctrico. Principio de isoelectroenfoque Electroforesis bidimensional Primera dimensión: Isoelectroenfoque Separación de las proteínas de acuerdo a su tamaño. Mismo tamaño y mismo punto isoeléctrico. Diferencias de un aminoácido cargado. Western blot, radioactividad y fluorescencia. El gel de isoelectroenfoque se situa en un gel de poliacrilamida/SDS Segunda dimensión: Electroforesis en gel de poliacrilamida/SDS Electroforesis bidimensional Más de 1.000 proteínas de Escherichia coli Geles bidimensionales Electroforesis bidimensional Bandas o picos de proteínas muy cercanos tienden a sobrelaparse, con métodos de una dimensión (SDS-PAGE o cromarografía), pueden resolver sólo un pequeño número de proteínas (menos de 50). Electroforesis de segunda dimensión, combina dos procedimientos de separación diferentes y puede resolver hasta 2.000 proteínas (bacteria). Problemas: + Poca precisión + Díficil reproducibilidad + Buenos ojos + Honestidad Análisis de Proteomas Propiedades Intrínsecas de Proteínas Espectrometría de masas Espectrometría de masas Determinación del tamaño exacto de proteínas intactas y de péptidos, después de digestión enzimática o química. Error de menos de una parte en un millón. Medición de masa de proteínas intactas de hasta 200.000 daltons (2.000 aa). Detección desde pocos picomoles a femtomoles. Espectrometría de masas • • • • Interacciones proteína – proteína Modificaciones post-traduccionales Proteómica estructural Cuantificación o modificaciones diferenciales de proteínas • Identificación de proteínas Espectrometría de masas La muestra es evaporada con vacío y expuesta a alto voltaje, convirtiendo las moléculas en iones en fase gaseosa. MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight spectrometry Espectrometría de masas Identification of Proteins by MALDI-MS 1. Sample isolation and preparation or Sample extraction and trypsinization or in-gel digestion 3. Database search for a peptide mass fingerprint (PMF) match 2. Sample peptides analysis Identification and sequencing of Proteins by Tandem MS (MS/MS) 1. Sample isolation and preparation 2. Sample peptides analysis or Sample extraction and trypsinization or in-gel digestion 3. Selected peptide(s) gated into MS collision chamber for controlled fragmentation and mass/charge analysis of fragments 4. Peptide sequence derivation from obtained peptides and aminoacids mass to charge values Identification of Unique Proteins by MALDI-TOF-MS 1. Sample isolation and preparation Control cells Treated cells 4. Database search for a peptide mass fingerprint (PMF) match 2. Sample extraction and trypsinization or in-gel digestion 3. Sample peptides analysis Espectrómetro de masas Espectrómetro de masas Espectrometría de masas Espectro de masas MALDI-TOF de insulina y b-lactoglobulina Espectrometría de masas Milk, a source of nourishment for all mammals, is composed, in part, of a variety of proteins. The protein components of milk are revealed by the technique of MALDI-TOF mass spectrometry, which separates molecules on the basis of their mass to charge ratio. Principle of ICAT-MALDI-TOF-MS (ICAT- Isotope-Coded Affinity Tags) Control cells Cysteine-selective ICAT reagents. Hydrogen and Deuterium labelled, chemically equivalent Treated cells Ligand for affinity purification Hydrogen and Deuterium-labelled linker Thiol-specific reagent Combine both labeled lysates and purify using affinity resin Isotope Coded Affinity Tags ICAT Análisis de Proteomas Interacción Proteína - Proteína Sistema de doble híbrido en levadura Sistema de doble híbrido en levadura Facilita el estudio de la interacción proteína – proteína. Si dos proteínas interactúan, entonces un gen reportero (gal1lacZ, el gen de la beta-galactosidasa) se activa, su transcripción. Se obtiene una reacción de color en un medio específico. Estudio de la interacción entre dos proteínas que se espera que interactúen. Encontrar proteínas que interactúan con una proteína previamente identificada. Sistema de doble híbrido en levadura La proteína Gal4 tiene un dominio de unión a DNA y un dominio de activación Sistema de doble híbrido en levadura El dominio de unión interactúa con el promotor El dominio de activación interactúa con la polimerasa Sistema de doble híbrido en levadura Se mide la actividad enzimática del gen reportero (colonias azules) Sistema de doble híbrido en levadura Los dos dominios de Gal4 pueden no ser transcritos como una sola proteína, mientras interactúen Fusión de genes. En levadura se pueden epxresar plásmidos con diferentes constructos Sistema de doble híbrido en levadura El dominio de unión como fusión traduccional con un gen que codifica otra proteína en un plásmido. El dominio de activación como fusión traduccional con un gen que codifica para una tercera proteína en un segundo plásmido. Yeast Two-hybrid Screen 1. Construct a DNA-BD - BAIT fusion expression vector. 2. Construct compatible cDNA library. DNA Binding Domain cDNA library Protein X (Bait) 3. Co-transfect: a) cDNA library, b) reporter vector, c) GAL 4 AD cDNAexpressing vector into competent yeast cells. 5. Isolate positive colonies, amplify plasmid DNA in E.coli and sequence. 4. Plate on selective medium to screen for positive interactions. GAL4 AD Protein X BAIT DNA-BD Reporter gene TATA UAS Comparison of yeast-based protein-protein interaction and identification screens GAL4 AD Yeast One-hybrid Reporter gene TATA Bait Sequence GAL4 AD Yeast Two-hybrid Protein X Protein X BAIT DNA-BD Reporter gene TATA GAL4 AD UAS Protein X1 Protein X2 BAIT Yeast Three-hybrid DNA-BD Reporter gene TATA UAS Yeast One-hybrid System 1. Construct a one-hybrid reporter vector with DNA bait sequence of interest. Generate a reporter yeast strain. 2. Construct compatible cDNA library (AD fusion library). DNA Bait sequence TATA Box His 3 Reporter cDNA library 3. Transfect the AD fusion library into reporter yeast strain cells. 5. Isolate positive colonies, amplify plasmid DNA in E.coli and sequence. 4. Plate on selective medium GAL4 AD Reporter gene DNA-BD TATA to screen for positive interactions. Yeast Three-hybrid Screen 1. Construct a DNA-BD - BAIT fusion expression vector. 2. Construct compatible cDNA library. DNA Binding Domain cDNA library Bait-1 3. Co-transfect: a) cDNA library, b) reporter vector, c) GAL 4 AD cDNAexpressing vector into competent yeast cells. 5. Isolate positive colonies, amplify plasmid DNA in E.Coli and sequence. 4. Plate on selective medium to screen for positive interactions. GAL4 AD BAIT 2 Protein X2 BAIT-1 DNA-BD Reporter gene TATA UAS Sistema de doble híbrido en levadura Análisis de Proteomas Función de Proteínas Chips de proteínas Chips de Proteínas Para comprender los sistemas celulares complejos se requiere la identificación y el análisis de cada uno de sus componentes y determinar cómo funcionan en conjunto y su regulación. Paso crítico en este proceso es determinar las actividades bioquímicas de las proteínas y cómo estás actividades son controladas y modificadas por otras proteínas. Tradicionalmente las actividades bioquímicas de proteínas se describían estudiando moléculas individuales, un experimento cada vez. Lento y mucho trabajo. Chips de Proteínas Microarrays analíticos Análisis mezcla compleja de proteínas. Afinidades de unión, especificidades y niveles de expresión. Librería de anticuerpos, aptameros o aficuerpos. Monitorización de patrones de expresión diferenciales. Diagnóstico clínico. Ejemplos: patrones de respuesta a estrés ambiental y tejido sano versus tejido enfermo. Chips de Proteínas Microarrays funcionales Proteínas funcionales completas o dominios de proteínas. Actividades bioquímicas de un proteoma. Interacción proteína-proteína, proteína-DNA, proteína-RNA, proteína-fosfolípido y proteína-pequeñas moléculas. Chips de Proteínas Microarrays de proteínas de fase reversa Células aisladas de diversos tejidos de interés, se lisan y se unen a una superficie de nitrocelulosa. Anticuerpos contra la proteína de interés. Detección quimioluminiscencia, fluorescencia o colorimetría. Presencia de proteínas alteradas en estados patológicos. Modificaciones post-traduccionales, comunes en estados patológicos. Chips de Proteínas Chips de Proteínas Chips de Proteínas Chips de Proteínas Diferentes superficies. Inmovilizar las proteínas en el chip. Mantener la conformación y la funcionalidad de la proteína. Obtener la máxima capacidad de unión. Considerar orientación aleatoria o Uniforme. Chips de Proteínas Orientación aleatoria: Superficie de aminas, aldehídos, derivadas de epoxy Recubrimiento de nitrocelulosa, gel, poli-lisina Orientación uniforme: Superficies con tags de afinidad Cubierta de niquel para usar con proteínas unidas al tag HisX6 Cubierta con estreptavidina Chips de Proteínas Chips de Proteínas Chips de Proteínas Para localizar las proteínas reactivas en el chip, se marcan pequeñas sondas de moléculas con tags fluorescentes, de afinidad, fotoquímicos o radioisotopos Chips de Proteínas Los métodos de detección fluorescente son los preferidos. Sencillos, seguros y extremadamente sensibles. Muy alta resolución. Compatibles con escaner de microarray estándar. Chips de Proteínas Chips de Proteínas Fosforilación 30% proteoma Regulación procesos celulares 4.000 eventos de fosforilación 1.325 proteínas diferentes en levaduras Chips de Proteínas Chips de Proteínas An in vitro phosphorylation map of yeast Connections between kinases and substrates Proteins of the same cellular compartment 87 different kinases (red dots) and 1.325 substrates (blue dots)