-4 تقدير وتعريف البكتيريا في األنسجة النباتيه Detection and Identification of Bacteria تعتمد كفاءة المقاومه علي درجه النجاح في إجراء اختيار سريع.
Download ReportTranscript -4 تقدير وتعريف البكتيريا في األنسجة النباتيه Detection and Identification of Bacteria تعتمد كفاءة المقاومه علي درجه النجاح في إجراء اختيار سريع.
Slide 1
-4تقدير وتعريف البكتيريا في األنسجة النباتيه
Detection and Identification of Bacteria
تعتمد كفاءة المقاومه علي درجه النجاح في إجراء اختيار سريع ودقيق في
تعريف البكتيريا وتقدير كثافتها .
طرق تقدير كثافة البكتيريا في األجزاء النباتيه المختلفة بما فيها البذور
أ ـ طرق مباشرة .
ب ـ طرق غير مباشرة .
ـ تعتمد هذه الطرق علي عده عوامل هى :الغرض المطلوب (هل بحث علمي
أو إجراء روتيني)
ـ موقع البكتيريا في النبات ـ عامل الزمن (هل مطلوب االختبار علي وجه
السرعة أم ان هناك متسع من الوقت) ـ األجهزة المعاونه ومدي توافرها ـ
مهارة المشخصين كثافة البكتيريا فى العينه ـ مستوى تعداد البكتيريا فى
الجزء النباتى والذى عنده تموت األعراض .
Slide 2
أ ــ الطـرق المبـاشرة
DIRECT DETECTIO
الـبــذور
1ــ طريقه االنبات والنمو Growing – On – Test
ويمكن تنفيذ هذه الطريقه في الصوبة الزجاجية أو في الحقل مباشرة
وهي تناسب البكتيريا التي تتواجد بنسبه عالية في البذور ( 1ـ )%10أى
نسبه 1ـ %10بذور مصابه في اللوط .وهذه الطريقه اكثر مناسبة في
حاله الفطريات المحمولة علي البذور عن البكتيريات حيث نجد ان اإلصانه
بالبكتيريات ال تتعدى 1و %0او أقل أي كثافتها قليلة .
Slide 3
وعليه فإننا قد نحتاج الي (10 000عشرة آالف) بذره كعينه للحصول علي
تعداد مقبول من الخاليا البكتيرية .لذلك فإن هذه الطريقه مكلفه جداً
ومضيعه للوقت .
من عيوب هذه الطريقه أيضاً هو تأثر البذور بالظروف البيئية ــ مشاكل
المحافظه علي نباتات خاليه من المرض لفترة طويلة ــ التداخل فى
األعراض مع الكائنات الممرضه األخرى .
ويعتمد تنفيذ هذه الطريقة علي زراعه البذور المحتمل إصابتها مباشره
في التربه ثم متابعة األعراض المرضيه المتوقع ظهورها على هذه العينه
من النباتات .
Slide 4
. وقدًاستخدمتًهذهًالطريقهًفيًالتعرفًعليًالبكتيريات
Xanthomonas campestris
pv. phaseoli
- Pseudomonas syringae pv. glycinae
Xanthomona
campestris
pv. campestris
- Pseudomonas syringae pv. pisi
Xanthomona campestris pv. malvacearum
Slide 5
2ــ طريقة الزراعة على البيئات الغذائية مباشرة خاصة البيئات نصف االختيارية
Semi Selective Media
أمثله تطبيقيه لتقدير البكتيريا :
أ ــ في بذور الصليبيات
تعقم البذور في محلول هيبوكلوريت الصوديوم (محلول الكلور) تركيزه % 5لمده 3
دقائق ثم تشطف وتجفف إما تحت Laminar Flow Hoodأو بين ورق
ترشيح معقم .
تزرع البذور تحت ظروف معقمه في اطباق بتري بها البيئات الغذائية المالئمة ثم
تحضن فتظهر النموات البكترية حول البذور المصابه(.توجد طرق ميكانيكية سريعة
لتنفيذ هذه الطريقه في أحواض بها بيئات غذائية تتسع كل منها لــ 1000بذره في
المكرره الواحدة) .
Xanthomonas
تظهـــر كفـــاءه هـــذه الطريقـــه فـــي الكشـــف عـــن البكتيريـــا
campestris pv. campistrisالمسببه للعفن األسود أو العرق األسود في
الصليبيات Black Rot or Black Vein In Crucifers
Slide 6
بًــًالطرقًالغيرًمباشره
INDIRECT METHODS
1ــًالطرقًالحيهً Viable Methods
تلقيحًالنباتًالعائل :
ومنها يتم حقن النبات بالمعلق المستخلص من البذور مباشرة .
أو الرش بالمستخلص الخام مباشرة .
أو إدخال الخاليا البكتيرية الي البذور تحت تفريغ Vaccum
Infeltrated With Extract
ثم تزرع البذور في غرفه نمو Growth Chamber
Slide 7
وعيب هذه الطريقة األخيرة هو إمكانية ظهور أعراض اخري ناشئة عن
اإلصابة ببعض المترممات أو بسبب األسلوب الخشن في التلقيح أو بسبب
الظروف البيئية الغير مالئمة لنشاط الميكروب ولتفادي ذلك يكون من
الضروري إعادة عزل المسبب من النباتات المصابه ثم يعاد زراعه البذور
واختبارها وبذلك تصبح هذه الطريقه مكلفه للغاية ومضيعه للوقت
أما ميزة هذا االختبار ان النبات العائل يعمل كطعم Baitحيث ان عددا
محدودا من البكتيريا يمكنها ان تتكاثر داخله وتعطي أعراضا .
العزل علي بيئة اآلجار :
يعتمد نجاح هذه الطريقه علي توافر Semiselective Midia
ومع ذلك فإنه من الممكن االعتماد مبدئيا على العزل علي البيئات العادية
Pseudomonas syringae
مثل البكتيريا pv.
phaseolicolaالتى يمكن عزلها علي بيئة (KB) King’s
”Medium “B
Slide 8
Xanthomonas campestris pv.
وأما البكتيريا
phaseoliفيمكن عزلها علي بيئة Nutrient Agar
وهذه الطريقه تظهر كفاءة في عينات البذور الملوثه بدرجه كبيرة بهذه
المسببات السابقه أو بأعداد بسيطة من المترممات لذلك وبسبب عدم توافر
هذه الظروف عاده فهذه الطريقه محدودة النجاح .
2ــًالطرقًالغيرًحيهًً Non Viable Methods
ليس من الضروري في هذه الطرق وجود الكائن الحي نفسه حيث يعتمد
التعريف علي التفاعل الكيماوي وتتميز هذه الطريقه بسرعتها وقله تكلفتها إال
ان نتائجها ال تعطي دليال قلطعا علي صحة النتائج الن الخاليا تكون ميتة وأن
الطرق السيرولوجية للخاليا الميتة اقل حساسية من طرق العزل والعدوي
وبالرغم من ذلك فإنها مازالت تستخدم في االختبارات الروتينية .
Slide 9
أًــًالطرقًالسيرولوجية
أسرع الطرق للتعريف وأكثرها فائدة كطرق معترف بها للتعريف خاصة
: للبكتيريات النامية وهذه تشمل علي
االختبار
المسببًالمرضى
وهذهًتستخدمًفيًحاله
.pv Pseudomonas syringae
phaseolicola
ًًوتصلحًفيًحاله
Pseudomonas syringae pv.
phaseolicola
pv. campestris Xanthomonas
phaseoli
طريقهًحساسهًجداًويمكنًمشاهدهًالخالياًمورتولوجيا
Pseudomonas syringae pv.
phaseolicola
pv campestris Xanthomonas
Xanthomonas
campestris
pv. phaseoli campestris
ًوتصلحًفيًحاله
.pv Pseudomonas syringae
phaseolicola
Agglutination Testًًً ــًاختبارًالتجلط1
Agar Diffusion testًًً ــًاآلجارًالمنتشر2
Immuno fluoresence Staning ً ــ3
(I F)
Enzyme Linked Immunosorbant ًًًًً ــ4
Assay
]ELISA]
Slide 10
وهذه االختبارات تحتاج الي كميات كبيرة من البذور وبالرغم من ذلك فهي
أساسيه في بعض الدول فمثال القانون الفرنسي ال يسمح بدخول بذور
الطماطم الي فرنسا دون شهادة الختبار ). (I F
وللطرق السيرولوجية أشكال مختلفة فمثالً الــ Agar Diffusian
Testطريقه غير حساسة ويمكن لالتتسيرم Antiseriumان
يتفاعل مع كل السالالت فال يظهر التخصص .
أما أهم اعتراض علي استخدام الطرق السيرولوجية هو ان اذا ظهرت
نتيجتها موجبه فإن النتائج تكون غير نهائية .
Slide 11
طريقةًااليليزاًً ELISA Test
((Enzyme Linked Immunosorbant Assay
فكرة االختبار
إحداث تفاعل بين Antibodies & antigenيمكن مشاهدته عن
طريق تعليم الــ Antibodiesبإنزيم ثم الكشف عن هذا االنزيم بإضافة
ماده يتفاعل معها فيتكون لون يمكن تقديره وقياس شدته بالطرق اللونيه
تشتهر هذه الطريقه في تعريف الــ Viroidsوتستخدم في تقدير الــ
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola
وبالتقدم السريع في تكنولوجيا الــ DNAواختبارات العدوي ربما ال تحتاج
مستقبالً الي تعريف البكتيريا خاصة عندما يتم التعرف علي الجين المرضي .
Slide 12
الخــــــــــــالصة
أفضل الطرق المتاحة حالياً خاصة في البكتيريات المحموله علي البذور هي
عزل المسبب المرضي علي بيئة نصف اختيارية ثم االختبارات السيرولوجية
) (I Fوالعينات التي تعطي نتائج موجبه يجري لها اختبارات العدوي
الصناعية .
-4تقدير وتعريف البكتيريا في األنسجة النباتيه
Detection and Identification of Bacteria
تعتمد كفاءة المقاومه علي درجه النجاح في إجراء اختيار سريع ودقيق في
تعريف البكتيريا وتقدير كثافتها .
طرق تقدير كثافة البكتيريا في األجزاء النباتيه المختلفة بما فيها البذور
أ ـ طرق مباشرة .
ب ـ طرق غير مباشرة .
ـ تعتمد هذه الطرق علي عده عوامل هى :الغرض المطلوب (هل بحث علمي
أو إجراء روتيني)
ـ موقع البكتيريا في النبات ـ عامل الزمن (هل مطلوب االختبار علي وجه
السرعة أم ان هناك متسع من الوقت) ـ األجهزة المعاونه ومدي توافرها ـ
مهارة المشخصين كثافة البكتيريا فى العينه ـ مستوى تعداد البكتيريا فى
الجزء النباتى والذى عنده تموت األعراض .
Slide 2
أ ــ الطـرق المبـاشرة
DIRECT DETECTIO
الـبــذور
1ــ طريقه االنبات والنمو Growing – On – Test
ويمكن تنفيذ هذه الطريقه في الصوبة الزجاجية أو في الحقل مباشرة
وهي تناسب البكتيريا التي تتواجد بنسبه عالية في البذور ( 1ـ )%10أى
نسبه 1ـ %10بذور مصابه في اللوط .وهذه الطريقه اكثر مناسبة في
حاله الفطريات المحمولة علي البذور عن البكتيريات حيث نجد ان اإلصانه
بالبكتيريات ال تتعدى 1و %0او أقل أي كثافتها قليلة .
Slide 3
وعليه فإننا قد نحتاج الي (10 000عشرة آالف) بذره كعينه للحصول علي
تعداد مقبول من الخاليا البكتيرية .لذلك فإن هذه الطريقه مكلفه جداً
ومضيعه للوقت .
من عيوب هذه الطريقه أيضاً هو تأثر البذور بالظروف البيئية ــ مشاكل
المحافظه علي نباتات خاليه من المرض لفترة طويلة ــ التداخل فى
األعراض مع الكائنات الممرضه األخرى .
ويعتمد تنفيذ هذه الطريقة علي زراعه البذور المحتمل إصابتها مباشره
في التربه ثم متابعة األعراض المرضيه المتوقع ظهورها على هذه العينه
من النباتات .
Slide 4
. وقدًاستخدمتًهذهًالطريقهًفيًالتعرفًعليًالبكتيريات
Xanthomonas campestris
pv. phaseoli
- Pseudomonas syringae pv. glycinae
Xanthomona
campestris
pv. campestris
- Pseudomonas syringae pv. pisi
Xanthomona campestris pv. malvacearum
Slide 5
2ــ طريقة الزراعة على البيئات الغذائية مباشرة خاصة البيئات نصف االختيارية
Semi Selective Media
أمثله تطبيقيه لتقدير البكتيريا :
أ ــ في بذور الصليبيات
تعقم البذور في محلول هيبوكلوريت الصوديوم (محلول الكلور) تركيزه % 5لمده 3
دقائق ثم تشطف وتجفف إما تحت Laminar Flow Hoodأو بين ورق
ترشيح معقم .
تزرع البذور تحت ظروف معقمه في اطباق بتري بها البيئات الغذائية المالئمة ثم
تحضن فتظهر النموات البكترية حول البذور المصابه(.توجد طرق ميكانيكية سريعة
لتنفيذ هذه الطريقه في أحواض بها بيئات غذائية تتسع كل منها لــ 1000بذره في
المكرره الواحدة) .
Xanthomonas
تظهـــر كفـــاءه هـــذه الطريقـــه فـــي الكشـــف عـــن البكتيريـــا
campestris pv. campistrisالمسببه للعفن األسود أو العرق األسود في
الصليبيات Black Rot or Black Vein In Crucifers
Slide 6
بًــًالطرقًالغيرًمباشره
INDIRECT METHODS
1ــًالطرقًالحيهً Viable Methods
تلقيحًالنباتًالعائل :
ومنها يتم حقن النبات بالمعلق المستخلص من البذور مباشرة .
أو الرش بالمستخلص الخام مباشرة .
أو إدخال الخاليا البكتيرية الي البذور تحت تفريغ Vaccum
Infeltrated With Extract
ثم تزرع البذور في غرفه نمو Growth Chamber
Slide 7
وعيب هذه الطريقة األخيرة هو إمكانية ظهور أعراض اخري ناشئة عن
اإلصابة ببعض المترممات أو بسبب األسلوب الخشن في التلقيح أو بسبب
الظروف البيئية الغير مالئمة لنشاط الميكروب ولتفادي ذلك يكون من
الضروري إعادة عزل المسبب من النباتات المصابه ثم يعاد زراعه البذور
واختبارها وبذلك تصبح هذه الطريقه مكلفه للغاية ومضيعه للوقت
أما ميزة هذا االختبار ان النبات العائل يعمل كطعم Baitحيث ان عددا
محدودا من البكتيريا يمكنها ان تتكاثر داخله وتعطي أعراضا .
العزل علي بيئة اآلجار :
يعتمد نجاح هذه الطريقه علي توافر Semiselective Midia
ومع ذلك فإنه من الممكن االعتماد مبدئيا على العزل علي البيئات العادية
Pseudomonas syringae
مثل البكتيريا pv.
phaseolicolaالتى يمكن عزلها علي بيئة (KB) King’s
”Medium “B
Slide 8
Xanthomonas campestris pv.
وأما البكتيريا
phaseoliفيمكن عزلها علي بيئة Nutrient Agar
وهذه الطريقه تظهر كفاءة في عينات البذور الملوثه بدرجه كبيرة بهذه
المسببات السابقه أو بأعداد بسيطة من المترممات لذلك وبسبب عدم توافر
هذه الظروف عاده فهذه الطريقه محدودة النجاح .
2ــًالطرقًالغيرًحيهًً Non Viable Methods
ليس من الضروري في هذه الطرق وجود الكائن الحي نفسه حيث يعتمد
التعريف علي التفاعل الكيماوي وتتميز هذه الطريقه بسرعتها وقله تكلفتها إال
ان نتائجها ال تعطي دليال قلطعا علي صحة النتائج الن الخاليا تكون ميتة وأن
الطرق السيرولوجية للخاليا الميتة اقل حساسية من طرق العزل والعدوي
وبالرغم من ذلك فإنها مازالت تستخدم في االختبارات الروتينية .
Slide 9
أًــًالطرقًالسيرولوجية
أسرع الطرق للتعريف وأكثرها فائدة كطرق معترف بها للتعريف خاصة
: للبكتيريات النامية وهذه تشمل علي
االختبار
المسببًالمرضى
وهذهًتستخدمًفيًحاله
.pv Pseudomonas syringae
phaseolicola
ًًوتصلحًفيًحاله
Pseudomonas syringae pv.
phaseolicola
pv. campestris Xanthomonas
phaseoli
طريقهًحساسهًجداًويمكنًمشاهدهًالخالياًمورتولوجيا
Pseudomonas syringae pv.
phaseolicola
pv campestris Xanthomonas
Xanthomonas
campestris
pv. phaseoli campestris
ًوتصلحًفيًحاله
.pv Pseudomonas syringae
phaseolicola
Agglutination Testًًً ــًاختبارًالتجلط1
Agar Diffusion testًًً ــًاآلجارًالمنتشر2
Immuno fluoresence Staning ً ــ3
(I F)
Enzyme Linked Immunosorbant ًًًًً ــ4
Assay
]ELISA]
Slide 10
وهذه االختبارات تحتاج الي كميات كبيرة من البذور وبالرغم من ذلك فهي
أساسيه في بعض الدول فمثال القانون الفرنسي ال يسمح بدخول بذور
الطماطم الي فرنسا دون شهادة الختبار ). (I F
وللطرق السيرولوجية أشكال مختلفة فمثالً الــ Agar Diffusian
Testطريقه غير حساسة ويمكن لالتتسيرم Antiseriumان
يتفاعل مع كل السالالت فال يظهر التخصص .
أما أهم اعتراض علي استخدام الطرق السيرولوجية هو ان اذا ظهرت
نتيجتها موجبه فإن النتائج تكون غير نهائية .
Slide 11
طريقةًااليليزاًً ELISA Test
((Enzyme Linked Immunosorbant Assay
فكرة االختبار
إحداث تفاعل بين Antibodies & antigenيمكن مشاهدته عن
طريق تعليم الــ Antibodiesبإنزيم ثم الكشف عن هذا االنزيم بإضافة
ماده يتفاعل معها فيتكون لون يمكن تقديره وقياس شدته بالطرق اللونيه
تشتهر هذه الطريقه في تعريف الــ Viroidsوتستخدم في تقدير الــ
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola
وبالتقدم السريع في تكنولوجيا الــ DNAواختبارات العدوي ربما ال تحتاج
مستقبالً الي تعريف البكتيريا خاصة عندما يتم التعرف علي الجين المرضي .
Slide 12
الخــــــــــــالصة
أفضل الطرق المتاحة حالياً خاصة في البكتيريات المحموله علي البذور هي
عزل المسبب المرضي علي بيئة نصف اختيارية ثم االختبارات السيرولوجية
) (I Fوالعينات التي تعطي نتائج موجبه يجري لها اختبارات العدوي
الصناعية .