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QBQ 0102 – Educação Física
Tecnologia do DNA recombinante
Carlos Hotta
18/06/13
A Tecnologia do DNA recombinante
• A tecnologia do DNA
recombinante nos permite
manipular sequências de DNA
e introduzi-las em novos
organismos
1975 – Escherichia coli capaz de produzir proteína de
Salmonella
Polimerase Chain Reaction
Gel de agarose
• O DNA é negativo e é atraído pelo pólo positivo do aparato;
• A malha de agarose atrapalha a migração de moléculas maiores, que acabam migrando
mais devagar no gel;
• O DNA é visualizado com marcadores fluorescentes e o tamanho produzido é estimado
com a adição de marcadores com o tamanho conhecido.
Plasmídeos
• Plasmídeos são DNA
circulares, muito menores
que um cromossomos
circular, que podem
complementar as sequências
do genoma da bactéria
• Plasmídeos são capazes de se
auto-replicar e podem
apresentar múltiplas cópias
em uma só célula
• Plasmídeos geralmente
possuem: origem de
replicação, um local de
múltiplos sítios de restrição,
um gene de resistência a
antibiótico
Enzimas de restrição cortam o DNA
• Enzimas de restrição são endonucleases com capacidade de cortar o DNA em
sequências específicas
• Geralmente reconhecem palíndromos no DNA
• Não nomeadas de acordo com seu organismo de origem -> Escherichia coli
Enzimas de restrição podem gerar pontas coesivas ou
pontas cegas
Há centenas de enzimas de restrição diferentes
Ligação
Transformação
• Bactérias podem incorporar um plasmídeo por choque térmico ou eletroporação
• No choque térmico há a incorporação de DNA após um tratamento rápido a 37oC a
42oC.
• Na eletroporação, um pulso de alta voltagem faz com que a memebrana da bactéria
permita a entrada dos plasmídeos.
Mas como usar genes de eucariotos em procariotos?
A transcriptase reversa transforma o RNA em DNA
• A transcriptase reversa nos
permite tornar o RNA
novamente em DNA (cDNA)
• O cDNA é mais estável que o
RNA e pode ser usado em
reações de PCR
• Geralmente as sequências
obtidas são de RNA maduro
Animais e plantas transgênicas
• Transgênicos são organismos
que tiveram seu genoma
alterado utilizando-se a
tecnologia do DNA
recombinante
• A agricultura convencional vêm
introduzindo genes novos nos
organismos faz anos
Como se gera animais transgênicos?
A Agrobacterium tumefaciens é capaz de tarsnferir
sequências definidas para o genoma das plantas
Sequenciamento de DNA usa di-deoxi nucleotídeos
Sequenciamento de DNA usavam 4 reações distintas de
replicação
Atualmente usa-se dideoxi nucleotídeos com marcadores
fluorescentes
• Automatização permite sequenciar
96 sequências por vez, 8 a 12 vezes
por dia
• 96 x 10 x 1000 = 960 mil pb por dia!
Novas técnicas de sequenciamento permitem a obtenção
de milhões de sequências simultâneas
• Pode-se obter o mesmo número de sequências que no Projeto Genoma em questão
de dias
• Existem diversas técnicas envolvidas que geram diversos tipos de sequências (de 50
pb a 10000pb) em diversas quantidades (de milhares a centenas de bilhões)
• Como analisar?
• A busca é a do genoma humano por U$1000 -> cada pessoa no planeta pode ter seu
próprio genoma sequenciado!
• Por quê sequenciar?
O 454 é um (velho) sequenciador de nova geração
O pirosequenciamento mede a luminescência produzida
quando um deoxinucleotídeo é incorporado
O segredo está na capacidade de isolar, amplificar e
sequenciar milhões de sequências em paralelo