Transcript Sequenciamento usando o Método de Sanger

Sequenciamento usando o
Método de Sanger
Luiz Claudio Santana da Silva
Maira Cicero Ferreira
Histórico
• 1975: primeira descrição do sequenciamento.
• Esse procedimento foi feito usando DNA polimerase,
primer, dNTP e ddNTP marcadas por 32P.
Sanger, Coulson, 1975.
dNTPs
Paulo José Pereira Lima Teixeira.
Tecnologias de sequenciamento de DNA.
ddNTPS
SANGER, NICKLEN, COULSON. 1997
ddNTPS
• Atkinson mostrou a atividade inibitória do
ddTTP (2´3´dideoxitimidina trifosfato).
• Após a incorporação do ddTTP ocorre a
inibição da síntese da cadeia.
ATKINSON, DEUTSCHER, KORNBERG, RUSSELL, MOFFATT. 1969
SANGER, NICKLEN, COULSON. 1997
Metodologia
• Desnaturação do DNA de dupla fita.
• Primers: iniciam a reação feita pela DNA
polimerase, nesse momento será definido
qual a cadeia que será usada como molde.
Sanger, Coulson, 1975.
Metodologia
• Usam-se baixas concentrações de ddNTPs e
altas concentrações de dNTPs.
• Em cada reação, um ddNTP é incorporado
aleatoriamente
ao
invés
do
dNTP
correspondente, provocando a terminação da
polimerização.
Sanger, Coulson, 1975.
ddNTP marcada por 32P
• Feitas 4 reações: uma para cada base ddNTP
marcada por 32P.
• Formados diversos fragmentos com tamanhos
variados, de acordo com a posição e o ddNTP
incorporado.
Sanger, Coulson, 1975.
ddNTP marcada por 32P
• Feito gel desnaturante de poliacrilamida.
• A autoradiografia é feita após a corrida do gel.
Sanger, Coulson, 1975.
Leitura
• Após autoradiografia a ordem dos
nucleotídeos, pode ser visualizada.
• Porém, esta será complementar ao molde.
Sanger, Coulson, 1975.
Paulo José Pereira Lima Teixeira.
Tecnologias de sequenciamento de DNA.
Sanger, Coulson, 1975.
Sequenciadores automáticos
• Criado em 1986 pela Applied Biosystems.
• O princípio é o mesmo do sequenciamento
manual feito por Sanger.
• ddNTPs são marcados por fluorescência
característica, permitindo a distinção das
cadeias
truncada
pela
respectiva
fluorescência.
Sequenciadores automáticos
• Feita a eletroinjeção onde as moléculas de
DNA(-) em suspensão são introduzidas nos
capilares.
• Cada fragmento, recebe um feixe de laser de
argônio, que será detectado por um sistema
óptico e uma câmara de CCD.
Sequenciadores automáticos
• A ordem em que os diferentes fragmentos
passam pelo detector de fluorescência indica
a sequência da cadeia de DNA complementar
à cadeia usada como molde.
Paulo José Pereira Lima Teixeira.
Tecnologias de sequenciamento de DNA.
Formato de saída – AB1
Formato de saída- AB1
Formato de saída – AB1
Formato de saída – PHD
Formato de saída – SEQ
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTCTTATATANNATTCCCGCCTTCNNTAAAGT
ATGCAAATAATGTCTGGTTTTAAAGTAATGATTAACTGCATGCTCAGGATAATAGG
GTTTGATGCCTTTATCCATGGGAAAATATTTGGTAACCTTAGGATAAAATCTAGCT
GGCATAACCAATTTTAATCTTCGTAATTCATTTTTAGTAAGTGGGCCTACAAATTGT
TCACATTTAGAAATCAGGTCTTGATGCAAATGAATATTAGGAAAAGAAGNANTGNA
CCAGTTAGGATTAAAAGCAGGCACAGTAGAAGAGTAAAGCCCCGTAAAGTTTCC
CACCTTATGAGTCCAAGGAATACTAACATTGGNAAGCTGGAGATTGAGATCTGCG
GCGACGCGGTGATTGAGATCTTCGTCTGCGAGGNGAGNNAGTTCTTCTNCTAG
GGGACCTGCCTCGTCGNCTAACAACAGTAGTTTCCGGAAGTGTGNATAGGATAG
GGGCNTTTGGTGGTCTGTANGCAGGANGAGTGCGAATCNNCACTCNNAAGGAC
ACCAAATACTCTAGNACTGTNCTCTTCCAAAAGTAAGGCAGGAAATGTGANNNNA
CANCAGNNGTCTANNTTNNNNNNNNNNNNNNNNAACNTAGNNAACTACTAAANC
CCTANCTNNNNCNNNNCANNNNNNNNNNCNCCCNAGNNNGCNANNNNCATNN
CCTNNNNCNNNANANNNNNNANNNTNNCTNNNNNCCNTNNNGNNNNNAANNNN
NNANNNNCAGNNNANNNNNNNNNNNNNNNNNAANNNNNNNNNNNNNNNTNNN
NNANNNNNNNNNNNNGGNNNANNCANNNNNN
Resumo do método Sanger
Paulo José Pereira Lima Teixeira.
Tecnologias de sequenciamento de DNA.
Principal aspecto positivo
• Leitura de fragmentos longos.
Principal aspecto negativo
• Valor elevado por base sequenciada.
RESUMO DAS PLATAFORMAS
Paulo José Pereira Lima Teixeira.
Tecnologias de sequenciamento de DNA.
RESUMO DAS PLATAFORMAS
Björn Nystedt, 2011
RESUMO DAS PLATAFORMAS
Björn Nystedt, 2011
Glenn, 2011
OBRIGADO (A) !