Transcript marcadores moleculares baseados em dna

MARCADORES MOLECULARES
BASEADOS EM DNA
Alberto José Prioli
Sônia Maria Alves Pinto Prioli
Nupélia - Universidade Estadual de Maringá
MARCADOR MOLECULAR (DNA)
Seqüência de bases com
localização única no genoma
e cujas variações podem ser
rastreadas em famílias e
populações.
Pode ou não ser
parte de um gene.
Marcadores Moleculares
RAPD
SPAR
AFLP
Microssatélites
RFLP
DNA
mitocondrial
Marcadores Moleculares
RAPD
SPAR
NÃO exige conhecimento
prévio do genoma
Microssatélites
Exige um conhecimento
parcial do genoma
DNA mitocondrial
NÃO exige conhecimento
prévio do genoma
Marcadores Moleculares
RAPD
SPAR
AFLP
Simples,
Baixo Custo
Imenso Número de Locos
Microssatélites
RFLP
Trabalhoso
Alto Custo
DNA mitocondrial
Mas... Dominantes
Co-Dominantes !
? Custo
Haplóide; Alto No Cópias
Herança Materna
Não Recombina
Evolução Rápida
COMO OBTER
ESTES
MARCADORES
MOLECULARES ?
DNA – Estrutura e Replicação
•
A seqüência de bases codifica a
informação genética.
•
Com um molde e um primer a
DNA polimerase sintetiza um
novo polinucleotídeo.
•
A necessidade de um primer permite a síntese in vitro (PCR) de
fragmentos de interesse.
PCR – Reação da Polimerase em Cadeia
•
•
•
•
•
•
•
Taq-polimerase
dNTP
Mg2+
Tampão
Primers
DNA
Ciclos com mudanças
de temperatura
A repetição d o ciclo amplifica o
o número de cópias do segmento
entre os sítios do par de primers.
O resultado é lido em gel.
Hot springs -Yellowstone National Park -USA
A “picture” of the bacteria
PCR (Polymerase Chain Reaction)
• Mullis & Faloona, 1987; Saiki et al., 1985.
• Eficiência na detecção de polimorfismo.
• Síntese enzimática de milhões de cópias na presença da DNA pol.
• Reação: anelamento e extensão com um par de primers
sintetizados artificialmente.
CICLO
Desnaturação Anelamento
Extensão
RAPD
Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso
 Técnica desenvolvida por Williams et al. (1990).
 Primer curto e arbitrário. Não se sabe, antecipadamente, em
em quais posições do genoma ocorrerão pareamentos.
 A amplificação é garantida por sítios de iniciação próximos e
em fitas opostas.
 Cada fragmento amplificado é uma característica binária
do indivíduo ou da população.
 Vantagens principais: baixo custo, grande número de
locos e não há necessidade de qualquer conhecimento
prévio do genoma do organismo.
Loco RAPD é um segmento amplificável,
incluindo os dois sítios de iniciação.
Cada loco pode ser tratado como um
sistema de DOIS ALELOS
A configuração do segmento que resulta em
amplificação é o ALELO DOMINANTE
A configuração que não amplifica é o ALELO
RECESSIVO (nulo)
A INFORMAÇÃO OCULTA PELA DOMINÂNCIA É PERDIDA:
não há como saber se a população está em
equilíbrio de HW, pois os heterozigotos não
podem ser identificados.
Marcadores RAPD
Parâmetros desenvolvidos para marcadores
co-dominantes podem ser estimados com RAPD,
admitindo-se equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Exemplos:
 Distâncias genéticas
 Índice de fixação FST (diferenciação genética)
 Número de migrantes (Nm)
 ...
Para amostras pequenas, a metodologia de
Lynch e Milligan (1994) miniminiza o erro
introduzido pela suposição de equilíbrio.
Nem sempre é necessária a suposição de equilíbrio.

Índices de similaridade (Jaccard ou outro)
 Coordenadas principais
 Componentes principais
 Componentes de variância da AMOVA
 Diversidade de Shannon
 ...
Estas análises não protegem contra a perda
da informação oculta pela dominância.
Usar RAPD?
Se para a espécie ainda não
existem marcadores mais
eficientes, decide-se diante
da relevância e urgência.
O RAPD gera estimativas menos
precisas, mas é muito útil como
ferramenta exploratória e em
combinação com marcadores
mais informativos.
Locos Microssatélites ou Simple Sequence Repeats (SSR)
Blocos de seqüências nucleotídicas de dois a seis pares de
bases que se repetem em tandem de 20 a 100 vezes. O genoma
humano contém cerca de 30.000 diferentes locos SSR.
Esta seqüência de pares de
bases não ocorre em nenhum
outro local do genoma.
Exemplo de um loco microssatélite:
Alelo (CAG)14
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1
½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½
5’...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’
3’...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’
Alelo (CAG)17
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½
5’...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’
3’...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’
Alelo (CAG)19
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½ ½
5’...AATGACATAGA....CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG.....GTCAAGATC...3’
3’...TTACTGTATCT....GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC.....CAGTTCTAG...5’
.
.
Alelo (CAG)n
Esta seqüência de pares de bases
não ocorre em nenhum outro
local do genoma.
AMPLIFICAÇÃO, VIA PCR, DE BLOCOS DE
MICROSSATÉLITES
5’...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’
3’...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’
5’...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’
CAGTTCTAG5’
5’AATGACATAGA
3’ ...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’
5’ ...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’
3’ ...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’
+
5’ ...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’
3’ ...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’
AMPLIFICAÇÃO DIRETA A PARTIR DE MICROSSATÉLITES
OU
Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) ou Single Primers Amplifications Reactions (SPAR)
O primer com três ou quatro unidades repetitivas. Amplificados segmentos localizados entre
dois blocos de microssatélites com a mesma unidade repetitiva do primer.
Exemplo de um loco ISSR:
Loco ISSR
5’...CAGCAGCAGCAGCAGCAGAAGTCATGGTCACGTGGCTGATATGACTGACATAGCCTCGAGTCTAGATCTATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG..3’
3’...GTCGTCGTCGTCGTCGTCTTCTGTACCAGTGCACCGACTATACTGACTGTATCGGAGCTCAGATCTAGATACGACGACGACGACGACGACGACGACGAC..5’
Blocos de microssatélites em posição cis e com
as seqüências repetitivas em fitas opostas.
Primer único a ser utilizado:
5’CAGCAGCAG3’
Amplificação via PCR:
5’...CAGCAGCAGCAGCAGCAGAAGTCATGGTCACGTGGCTGATATGACTGACATAGCCTCGAGTCTAGATCTATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG..3’
GACGACGAC5’
5’CAGCAGCAG
3’...GTCGTCGTCGTCGTCGTCTTCTGTACCAGTGCACCGACTATACTGACTGTATCGGAGCTCAGATCTAGATACGACGACGACGACGACGACGACGACGAC..5’
Marcadores Moleculares
RAPD
SPAR
AFLP
Simples,
Baixo Custo
Imenso Número de Locos
Microssatélites
RFLP
Trabalhoso
Alto Custo
DNA mitocondrial
Mas... Dominantes
Co-Dominantes !
? Custo
Haplóide; Alto No Cópias
Herança Materna
Não Recombina
Evolução Rápida
Marcadores Moleculares Mitocondriais
Metodologia
•
•
•
•
•
•
Escolha da Seqüência (Qual é o Objetivo?)
DNA Total
Amplificação via PCR
Clonagem do Fragmento
Seqüenciamento
Seqüência: Edição e Alinhamento
mtDNA
•
•
Geralmente evolui 5-10 vezes mais rápido do que
genes nucleares de cópia simples.
Alta velocidade de evolução - No Transição > Transversão
• CO I, II, III e Citocromo b
• ND, ATPases
= Evolução + lenta (conservados)
= Evolução menos lenta (~menos conservados)
• tRNAs
= Evolução lenta; pequenos (59-75 bp) (primers)
• rRNAs
=
Evolução lenta (interessantes p/ espécies distantes)
• D-Loop ou Região Controle
= Mais variável do mtDNA.
FRAGMENTOS D-loop DE 450 pb de
Astyanax (lambari)
600 pb
ELETROFEROGRAMA (EDIÇÃO NO COMPUTADOR)
Picos com as cores correspondentes a cada nucleotídeo.
OBTENÇÃO DE
INFORMAÇÕES
ECOLÓGICAS COM
MARCADORES
MOLECULARES
Molecular Markers and Genetic
Variability of Hoplias aff. malabaricus
Populations from the Floodplain of
Upper Paraná River
PRIOLI1,2*, Alberto J.; LUCIO1, Léia C.; MANIGLIA1, Thiago C.; PRIOLI1,2,
Sônia M. A. P.; JÚLIO Jr1,2, Horácio F.; PAZZA1, Rubens; PRIOLI1,3, Laudenir
M.
1Nupélia – Núcleo de Pesquisas em Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura; 2Depto. Biol. Celular e
Genética; 3Depto. Biologia – Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900
Maringá, PR, Brazil. *Autor para correspondência (Phone: 44-261-4750; Fax: 44-263-1424; email: [email protected])
30’
54º
ma
ne
pa
na
ra
Pa
nh
eim
ná
ra
Pa
aná
Par
Rio
Iv i
MATO GROSSO
DO SUL
Rio
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R
a
BRASIL
11
Porto Rico
23º
Rio
Am
amb
aí
Rio Ivai
30’
Rio
Igu
a te
mi
Rio P
araná
30’
Planície de inundação
do alto rio Paraná
Base Nupelia-UEM
em Porto Rico - PR
PARANÁ
24º
24º
Sete Quedas
GUAÍRA
Rio Igu
açu
30’
S.
eiro
Fco Verdad
.
IL
30’
PARAG
UAY
Rio
Piqu
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Fco.
25º
Fal
so
Reservatório de Itaipu
BRA S
SANTA HELENA
Riv
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i
Oco
Rio
Foz do Iguaçu
SCALE
21.4 km
ITAIPU DAM
30’
30’
FOZ DO IGUAÇU
30’
54º
30’
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54º
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do alto rio Paraná
Base Nupelia-UEM
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Foz do Iguaçu
21.4 km
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FOZ DO IGUAÇU
30’
54º
30’
Atualmente ocorrem três citótipos de
Hoplias aff.
malabaricus na planície
alagável do alto rio Paraná:
A (42)
C (40)
D (39/40) macho/fêmea
O citótipo C invadiu a planície
depois do barramento de Itaipu.
Figure 1 – DNA fragments amplified by PCR with SPAR primer (GGAC)3T,
identifying Hoplias aff. malabaricus cytotypes A, C, and D from the floodplain
of Upper Paraná River. (L) Molecular weight markers (Ladder 100 bp); (b)
negative control without DNA.
HPL4
HPL17
100 HPL20
HPL18
Dados sobre Citótipo C na
planície Conclusão
HPL21
HPL19
HPL6
HPL5
99
76 HPL7
HPL35
HPL16
99
66
HPL8
100 HPL36
0.01
Figure 2. Neighbor-joining tree for mitochondrial control region sequences of
Hoplias malabaricus specimens from the Upper Paraná River Foodplain. Genetic
distance was computed by using Tamura and Nei (1993) method. Number on
each node indicates bootstrap probability based on 1000 replications.
O monitoramento com
ISSR evidenciou que o
grupo C é o mais
freqüente na planície,
nos ambientes lóticos,
semi-lóticos e lênticos.