Transcript Aula_10 - Genética
Marcadores Moleculares
Até meados da década de 60
Marcadores morfológicos de fácil identificação Ex.: características das ervilhas de mendel; nanismo; deficiência clorofítica etc.
MARCADORES MOLECULARES:
todo fenótipo molecular oriundo de um gene expresso, ou de um segmento específico de DNA;
a sequência de nucleotídeos e a função de um marcador molecular podem ou não ser conhecidas;
ao se verificar o seu comportamento de acordo com as leis básicas de herança de Mendel, um marcador molecular é adicionalmente definido como marcador genético.
Isoenzimas
grupo de múltiplas formas moleculares da mesma enzima que ocorre em uma espécie, como resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas;
diferenças na mobilidade de isoenzimas em um campo elétrico são resultantes de diferenças nas sequências de DNA que codificam tais enzimas;
co-dominante, ou seja, genótipos heterozigotos e momozigotos de um determinado loco são facilmente identificados.
Ex. Anemia Falciforme - a hemoglobina de pessoas saudáveis e com anemia movem-se para posições diferentes - Ácido glutâmico
Valina
Vantagens Desvantagens técnica barata e acessível
poucos locos; co-dominantes
baixo polimorfismo por loco;
limitada a regiões transcritas;
material deve ser fresco; influencia das condições ambientais; estágios diferentes de desenvolvimento; dificil interpretação dos zimogramas; Marcadores Moleculares
RFLP – “Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição”
DNA de indivíduos distintos difere na sequência de nucleotídeos ao longo da fita; a presença ou ausência de sítios de restrição pode variar entre indivíduos;
inserções/deleções/inversões na sequência de DNA de diferentes indivíduos podem alterar a distância entre pares de sítios de restrição.
Marcadores Moleculares
Ex. 1 – Anemia Falciforme Ex. 2 – Fibrose Cística
Alelo Normal: NH2 – Leu-Glu-Asn-Ile-Ile Fen -Gli-Val-COOH Alelo F508: NH2 – Leu-Glu-Asn-Ile-Ile . . .
-Gli-Val-COOH
Vantagens Desvantagens nº de locos praticamente ilimitado; nivel de polimorfismo > isoenzimas co-dominantes; sondas de cDNA ou não PCR facilitou muito
muito laboriosa (melhorou com PCR); necessidade de sondas disponíveis; manuseio de material radioativo; Marcadores Moleculares
RAPD – “Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso”
Geração de marcadores baseado na técnica de PCR; utiliza um primer único relativamente curto (
10 nucleotídeos);
primer único com sequencia arbitrária, portanto, sua sequência alvo é desconhecida;
duas sequências complementares ao primer arbitrário devem estar próximas (<4000pb) e em orientação oposta.
Marcadores Moleculares
Ex. 1 – “Fingerprint” para duas variedades de Uva Ex. 2 – Detecção de RFLP em fragmentos monomórficos RAPD
Vantagens Desvantagens técnica muito simples e barata; nº de locos praticamente ilimitado; alto nível de polimorfismo; quantidade mínima de DNA necessária; cobertura de todo o genoma.
Dominante; difícil interpretação de algumas bandas; baixa reprodutibilidade; Marcadores Moleculares
AFLP – “Polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado”
combina a especificidade e resolução da digestão com enzima de restrição com a velocidade e praticidade da PCR;
geração de marcadores baseado na técnica de PCR; consiste em 4 estapas principais: a) DNA genômico total é clivado com 2 enzimas de restrição; b) adaptadores específicos são ligados aos terminais gerados pelas enzimas de restrição; c) uma fração dos fragmentos gerados é amplificada via PCR utilizando primers que reconhecem as sequências dos adaptadores; d) a população de fragmentos amplificados é separada em géis de alta resolução.
Vantagens Desvantagens
grande número de locos analisados; Extremamente polimórfico; quantidade mínima de DNA necessária; maior robustez quando comparado ao RAPD; cobertura de todo o genoma.
Dominante; Exige um grande número de etapas; DNA deve ser mais puro; marcação radioativa Marcadores Moleculares
SSR (“Sequencias simples repetidas” ou “Microssatélites”)
consistem de pequenas sequências, com 1 a 4 nucleotídeos de comprimento, repetidas em tandem: Ex: (GA)n, (TG)n, (AGC)n, etc.
já foram descritos no nDNA, cpDNA e mtDNA; polimorfismo devido ao “escorregão” natural da polimerase Marcadores Moleculares
Um único locos SSR pode apresentar mais de 50 alelos...
Detecção de SSR em gel ou sequenciador...
Multiplex...
Vantagens Desvantagens hipervariáveis co-dominantes cobertura de todo o genoma; baseados em PCR;
grande trabalho (biblioteca de SSR) para desenvolvimento prévio dos marcadores
Exige marcação radioativa ou uso de sequenciador automático Marcadores Moleculares