Transcript Polymerase Chain Reaction (PCR) Pedro Teiga Ricardo Ladeiras

Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Pedro Teiga
Ricardo Ladeiras
Sofia Marques
21 Abril 2005
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A invenção da PCR
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1983 Kary
Mullis
1985 1º paper
1993 Nobel da
Química
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PCR, a ferramenta do futuro
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Grande quantidade de DNA em pouco tempo.
Baixo custo
A amostra de DNA não necessita de estar altamente
purificada.
PCR pode amplificar uma única molécula de DNA /
RNA.
O produto do PCR pode ser digerido com enzimas de
restrição, sequenciado ou clonado.
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A reacção
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O que envolve a reacção?


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
DNA Template
Tampão da reacção (Tris, iões amónio (e/ou iões de
potássio), iões de magnésio soro de albumina de
bovino)
Nucleótidos (dNTPs)
Primers
DNA polymerase (pex: Taq, Pfu)
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Quantos ciclos?
6
Termo-Cicladores
7
Funcionou?

Se não…o que fazer?
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Optimização da reacção de PCR
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

Temperatura
Tempos
Concentração de
Mg2+ na reacção.
Quantidade de
template e de
polymerase
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DNA polimerases..
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E. coli
Taq
Pfu – proofreading
rTth DNA
Polymerase
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Fidelidade da reacção
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A Taq comete ERROS

Qual a importância dos erros?

Como superá-los?
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Concepção dos PCR Primers
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Comprimento: especificidade vs eficácia
Temp de annealing
Composição de bases
Extremidade 3’
Regiões repetitivas do DNA
Enzimas de restrição
Estrutura secundária

Homologias Intra e Inter-primer
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Primers a formar Hairpins e Dímeros


Complementaridade intra-primer –
dobra em hairpin:
Dímero de primers (intra ou inter
primer).
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Aplicações do PCR
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Multiplex PCR
Real Time PCR
PCR na detecção de polimorfismos e mutações patológicas
PCR e a amplificação indiscriminada de sequências de DNA
PCR na amplificação de sequências de DNA desconhecidas
PCR assimétrico
PCR e clonagem de DNA genómico
PCR e clonagem de cDNA
PCR e DNA Fingerprinting: casos da Biologia Forense e da
Filiação genética
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Multiplex PCR
15
Real time PCR
16
PCR usado na detecção de
polimorfismos e mutações
patológicas
17
Para detectar polimorfismos de local de restrição
•
O que são polimorfismos?
•
Porque existem os
polimorfismos?
•
Como se detectam esses
polimorfismos?
18
PCR específico para um alelo e detecção de mutações
•
Como se consegue
discriminar entre duas
sequências alvo que
difiram num único
nucleotídeo?
•
Um só nucleotídeo faz
a diferença?
•
Como se interpretam os
resultados?
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PCR permite amplificação
indiscriminada de sequências de
DNA
•
Qual a vantagem?
20
Linker-primed PCR
•
Como decorre?
•
O que é o linker?
•
Que primers são usados?
21
PCR usado para amplificar uma
regiões desconhecidas que
flanqueiam uma região
previamente caracterizada
•
Qual a vantagem?
22
PCR inverso
•
Quando se utiliza?
•
Como são os primers?
•
Como decorre o
processo?
23
Os produtos amplificados do PCR
são usados na sequenciação de
DNA
24
PCR assimétrico
•
Com que fim se utiliza?
•
Porquê assimétrico?
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Clonagem de
DNA genómico
↓
Clonagem de cDNA
↓
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PCR e DNA Fingerprinting
Exemplo: “locus” D1S80
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PCR e DNA Fingerprinting
Suas principais aplicações:
 Biologia forense (ex. confirmação do autor de
um crime)
 Filiação genética (ex. testes de paternidade)
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PCR e Filiação genética
Pai
Mãe
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O futuro da PCR
PCR ↔ material genético
Fotocopiadora ↔ material escrito
tornando a cópia
fácil, barata, acessível
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O futuro da PCR
Com a técnica de PCR iremos desvendar o nosso passado
genético, bem como abrir o caminho para um futuro
geneticamente traçado.
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Agradecimentos
•
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Este trabalho foi possível com a ajuda de..
Drª. Clara Monteiro
Drª. Susana Pereira, IBMC
Drª. Marta Pinto
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Referências
•Tom Strachan, Andrew P. Read Human: Molecular
Genetics;BIOS Scientific Publishers Limited; 1996; USA
•James D. Watson, Michael Gilman, Jan Witkwoski, Mark
Zoller: Recombinant DNA; second edition; 1992; New
York,Scientific American Books
•Geoffrey M Cooper: The Cell, a molecular approach;
second edition
•Alkami quick guide tm for PCR
•Rui Pereira; Biologia forense; Nov 2004
•A. Silva, A. Fonseca, C. Teixeira, E. Sousa; FCUP; Testes
de paternidade
•Raymond Dalgleish; Department of Genetics; The
Polymerase Chain Reaction (PCR)
•Site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books
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