Transcript Sequenciamento de DNA em MegaBACE DNA Analysis Systems

Sequenciamento de DNA em
MegaBACE DNA Analysis Systems
• Prof. Dr. Luciano da Silva Pinto
[email protected]
TGTGAACACACGTGTGGATTGG...
Sequenciamento do DNA
Definição
Identificação da ordem exata dos pares de bases (A, T, G e C)
em um segmento de DNA.
Importância
O conhecimento da seqüência de bases de um gene fornece importantes
informações sobre sua estrutura, função e relação evolutiva com outros
genes (de um mesmo organismo ou de organismos diferentes).
Análise do fluxo da informação celular pela
pesquisa genômica
Histórico – O sequenciamento de DNA no tempo
Watson & Crick
Nobel 1962
Histórico – O sequenciamento de DNA no tempo
Frederick Sanger
Prêmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980
J. Mol. Biol. v.94, p. 441-448, 1975
Walter Gilbert
Prêmio Nobel de medicina e fisiologia em 1980
PNAS, vol. 74 No. 2 p. 560-564, 1977
Seqüenciamento de DNA
Projeto
Genoma
Humano
Tecnologias de sequenciamento
- Maxam & Gilbert, método químico- 1972
- Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977), n. 12, 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb/24 horas)
- Pirosequenciamento
- Science 281 (1998), n. 5375, 363-365
- Nature 437 (2005), 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb/24 horas)
Método de Sanger
• Reação de seqüenciamento
– amplificação linear
• Eletroforese em gel de acrilamida
– em placa
– capilar
• Leitura da seqüencia
– manual
– automática
Reação de seqüenciamento
•
•
•
•
•
fragmento de DNA (fita simples)
1 primer
DNA polimerase
dNTPs
OH
ddNTPs
H
Eletroforese
• em placa
• capilar
Reação de sequenciamento e marcação
do DNA
Leitura das sequências Manual
Radioisótopos
Leitura das sequências Automática
Fluoresceínas
Leitura da seqüência de DNA
• Manual
GATC
Leitura da seqüência de DNA
• Automática
Reação de sequenciamento e leitura automatizada
anelamento dos primers
denaturação
Organizando as Seqüências de DNA
5’
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCT
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3’
Exemplo de gel utilizado nos seqüenciadores de gel (ex.: 377). A diferença de
tamanho permite a separação dos grupos de fragmentos, e esta
“distribuição normal” da passagem dos fragmentos é representada pelo
eletroferograma (ou cromatograma) de cada seqüência (read).
Generic Sequencing Instrument
Electrical Field
-
Laser
+
GCTATAGTTGATTCCT
DYEnamic ET Terminators – Pré Mix
Energy Transfer Dyes
•Fluorescein Donor Dye
•Standard Rhodamine Acceptor Dyes
Fluorescein-R110-ddGTP
Fluorescein-R6G-ddTTP
Fluorescein-TAMRA-ddATP
Fluorescein-ROX-ddCTP
N
O
N+
CO2-
ddNTP
Transferência de energia
aumenta a fluorescência
Ar+
Laser
OH
O
Radiationless
O
CO2- Energy
Transfer
ddNTP
N
O
N+
CO2-
DYEnamic ET terminator - espectro de
emissão
Normalized Fluorescence Emission
(Excitation at 488 nm)
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
500
550
600
Wavelength (nm)
650
700
Leitura da seqüência de DNA
Análise dos resultados
por Bioinformática
Montagem
Limpeza das seqüências:
􀂄remoção de seqüências ribossômicas
􀂄remoção de seqüências de vetor
􀂄remoção da região de poliA
􀂄corte por qualidade
􀂄eliminação das derrapagens
Shotgun do genoma inteiro
DNA genômico
Quebrar em pedaços
aleatórios ~2000pb
(shotgun)
reads
clonar em vetor
sequenciamento
Reconstrução do DNA original a partir do fragmentos
(clusterização)
reads
Sequência consenso
(DNA original)
A reconstrução é feita a partir de sobreposição dos fragmentos
Shotgun de pedaços do genoma
Quebrar em pedaços
aleatoriamente desde
50Kpb até 300Kpb
DNA genômico
Clonar em BAC’s e
sequenciar apenas as
pontas de cada fragmento
~800 bp
~800 bp
Quebrar em pedaços de
2000pb
clonar em vetor e
sequenciar os fragmentos
O programa PHRED lê o chromatograma identificando e dando uma
nota para cada base que forma a sequência :
0 0 5 6 7 10 10 9 12 15 20 20 30 30 35 40 41 45 50 56 56 50 40 ...
Genome Research 8 (3) (1998), 175-185
background
- A identificação dos picos é feita através de uma transformada de
fourier do sinal
- A nota é ligada com a resolução entre os picos vizinhos e a altura
do background
Analisando o cromatograma
Região de qualidade alta
•
•
•
Picos bem definidos e grandes.
Linha de base boa.
Distância entre picos anterior e posterior constante.
Região de qualidade média – poucas ambigüidades
•
•
•
Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio.
Linha de base boa a razoável.
Distância entre picos anterior e posterior razoável.
Região de qualidade baixa – baixa confiabilidade
•
•
•
Picos mal definidos e de tamanho pequeno.
Linha de base confusa.
Distância entre picos anterior e posterior inconstante.
- Sequenciamento produz seqüências da ordem de 500 pb
Onde q é a nota phred e P é a probabilidade encontrar uma base
errada :
- Nota phred = 20 => 1 base errada a cada 100 (99%)
- Nota phred = 30 => 1 base errada a cada 1000 (99.9%)
Pirosequenciamento
Science 281 (1998), n. 5375, 363-365
Shotgun do genoma inteiro
DNA genômico
Quebrar em pedaços
aleatórios ~2000pb
(shotgun)
Ligação do
adaptador e
separação em fita
simples
Pirosequenciamento
- O adaptador permite que o DNA se ligue em grânulos minúsculos (diâmetro
de 28 mm). Apenas um DNA é ligado em cada grânulo
- Os grânulos são envolvidos em gotas de óleo que contêm todos os
reagentes necessários para amplificar o DNA
- Cada gota contendo o grânulo é mantida isolada para evitar contaminação e
consegue produzir 10 milhões de cópias numa reação de pirosequenciamento
- Um pmol de DNA numa reação de pirosequenciamento produz 1011
moléculas de ATP gerando mais de 109 fótons, num comprimento de onda de
560 nm, e num período de 3-4 segundos. Facilmente detectado por uma
câmera de CCD
Nature 437 (2005), 326-327
O sequenciador 454
Câmera de
CCD
Câmara de fluxo
contendo as amostras
e as fibras ópticas
(1,6 milhões/slide)
Bombeamento
de fluídos
Computador
Nature 437 (2005), 376-380
Pirograma
Linearidade é mantida até homopolímeros de 8 nt
São obtidas seqüências de até 100-120 b
Sanger vs Pirosequenciamento
SANGER
• Depende de clonagem em
bactéria (2 semanas de
trabalho)
Pirosequenciamento
• Não há clonagem
• 1 milhão de pb em 24 horas
• 25 milhões de bp em 4 horas
(100x mais rápido)
• Reads de ~700 bp
• Reads de ~100 bp
• Clones de fita dupla
permitem seqüenciamento
em ambas direções (facilita
orientação e montagem)
• Fragmentos fita simples não
permitem seqüenciamento em
ambas direções
• 6 meses de sequenciamento,
24 horas por dia, para
sequenciar o genoma de um
fungo
• 24 horas para sequenciar o
genoma de um fungo
Conclusão : a união faz a força
PNAS 103 (2006), 11240
Os organismos possuem padrões
As moléculas também.
Evolução
Daehhhh
!
Caracteres morfológicos
Macadores moleculares
Sequências
Similaridade X Homologia
A homologia deve ser uma
conclusão feita pela observação da
similaridade.
Transferência horizontal
Um alto índice de similaridade
entre as sequências justifica a
conclusão de que elas
são homólogas
?
1859: Charles Darwin A Origem das Espécies
1831-1836: Viagem do Beagle
2004-2006: Viagem do Sorcerer II
Animações
• http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/sangers
eq.html
• http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/cycseq.
html