Transcript Tecnologia do DNA recombinante
Tecnologia do DNA recombinante
•A deficiência de hormônio do hormônio do crescimento com que a pessoa fique com uma estatura baixa. Nesses casos, é necessário o uso crescimento para que faz o crescimento dessas crianças melhore.
•O hormônio do crescimento primeiros produtos da foi um dos engenharia genética .
•Ele foi produzido em E. coli a partir de um gene humano fusionado com elementos reguladores bacterianos.
•Esse foi o segundo produto farmacêutico aprovado pelo FDA, em 1985.
•O primeiro foi a insulina humana , em 1982.
Como amplificar um gene de interesse
Tipo de DNA doador
• DNA genômico • cDNA – DNA complementar
cDNA – contém apenas os éxons
vetor DNA de interesse Formação de uma molécula de DNA recombinante
Enzimas de Restrição
Como funciona a amplificação
VETORES Plasmídeos : são moléculas de DNA circulares, extracromossômicas, presentes em microrganismos, sendo que muitos se replicam autonomamente.
Estrutura de dois plasmídeos
Vetores de bacteriófagos
• A maioria fago labda • Genoma do fago: 48.502pb
• 15kb são necessários para a lisogenia e podem ser removidos.
Clonagem usando o fago como vetor
Vetores cosmidiais
• É um híbrido entre plasmídeos e o fago labda • Vantagens: capacidade do plasmídeo de replicação autônoma • Capacidade do fago de embalagem do cromossomo • Capacidade de 35 a 45kb
Estrutura de um cromossomo artificial bacteriano (BAC) usado para clonar grandes fragmentos de DNA (150 a 300kb)
Construção de bibliotecas de DNA
• Conjunto de clones de DNA, contendo coletivamente todo o genoma.
• DNA total restrição digestão com enzimas de inserção em vetores
• Uma boa biblioteca tem todas as sequencias de DNA do genoma.
• Para genomas grandes são necessários milhares de clones • O número de clones pode ser calculado: • N=(ln(1-P)/(ln(1-f) • P : probabilidade, f : fração do genoma em um clone de tamanho médio
Exemplo
•
Drosophila
• Inserto 40kb genoma 100.000kb
• Probabilidade de 99% de certeza de uma seqüência estar na biblioteca: • N=(ln(1-0,99)/(ln(1-(40/100000) • N=11.513 clones
Exercício
• O genoma humano tem 3 bilhões de nucletídeos • Utilizando BACs: insertos de 200kb • Quantos clones são necessários para ter uma certeza de 95% de ter uma seqüência específica na biblioteca?
• N=44.979