Engenharia do DNA

María Julia Barison

BMP-5777 Biologia Molecular e Bioquimica de proteínas alvo a drogas do parasita da malária humana

Plasmodium falciparum

USP - 2012

DNA recombinante: qualquer molécula de DNA composta de sequencias derivadas de diferentes organismos.

Organismos geneticamente modificados (OGMs): qualquer organismo gerado a partir da introdução de DNA recombinante.

Aplicações:



Medicina

 Produção de hormônios como insulina ou fatores de crescimento  Produção de vacinas 

Pesquisa

   Produção de proteínas recombinantes knock-out e superexpressão de genes para estudos funcionais Estudos de expressão e localização subcelular (genes  repórteres)

Melhoramento animal e vegetal (OGMs)

1. Fragmento de DNA de interes + Vetor 2. DNA recombinante 3. Replicação do DNA recombinante em células hospedeiras 4. Isolamento, sequenciamento e manipulação do fragmento de DNA purificado

1. Fragmento de DNA de interes + Vetor

DNA • PCR • Livrarias de DNA • Plasmídeo  Origem de replicação (ORI)  Marcador de seleção (resistência a ATB)  Polylinker (sítios de corte únicos para diferentes ER) VETOR • • • Bacteriófago Lambda/Cosmidos BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) YAC Molecular Cell Biology, 5ta edição

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Tipo

Tipo I Tipo II Tipo III

Estrutura

Multifuncional, várias subunidades Restrição e modificação em enzimas diferentes Multifuncional, várias subunidades

Cofatores

Mg2+, ATP, AdoMet Asimétrico Mg2+ Mg2+, ATP,

Sítio de reconhecimento Sítio de corte

Palindrómicos Asimétrico Aleatóriamente, a distância médias de 1000 pb.

Dentro da sequencia de reconhecimento*.

A uma distância de 25-27 pb da seq de reconhecimento.

*Extremos produzidos pelas enzimas tipo II: Bickle and Krüger (1993); Molecular Cell Biology, 5ta edição

LIGASES OUTRAS ESTRATÉGIAS DE CLONAGEM Vetores tipo T - ligação Clonagem por recombinação

Replicação do DNA recombinante em células hospedeiras

Transformação: • Shock térmico • Electroporação

4. Isolamento, sequenciamento e manipulação do fragmento de DNA purificado

Molecular Cell Biology, 5ta edição

MUTAGÊNESE SÍTIO-DIRIGIDA Tipos de mutação:

• • • Pontual Deleção Inserção

Sem Mutação Silenciosa Mutação Pontual Nonsense Missense conservativa Não -conservativa

ESTRATÉGIAS

Introdução da mutação desejada + sítio de restrição Sequencia de interes Sítio de restrição que permitirá o screening de clones mutantes Introdução da mutação desejada Primer que introduzirá ou eliminará um sítio de restrição Se um sitio foi eliminado, ele pode ser utilizado para aumentar a proporção de clones mutados.

Sistema pALTER

Mutagênesis sítio dirigida mediante Overlap Extension PCR

PCR Desnaturação Clonagem Re-hibridação Extensão Amplificação Ho, S. N et al (1989)

Screening dos clones mutados:

• Análise por digestão com enzimas de restrição • Identificação do clone por hibridação com sonda marcada Colonias de bacterias levando o plasmídeo mutado Membrana de nitrocelulosa Incubação da membrana com solução alcalina DNAss unido à membrana Hibridação com sonda marcada Sinal positivo Adaptado de Molecular Cell Biology, 5ta edição

Obrigada pela atenção!!...