Transcript Aula_09

Tecnologia do DNA Recombinante
Enzimas de Restrição (endonucleases): tesouras do DNA
enzimas produzidas por bactérias para restringir a proliferação de vírus invasores;
diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequências de bases de DNA;
reconhecem e clivam o DNA em pontos específicos, geralmente em sequências
de 4, 6 e 8 bases – palíndromas.
Nomenclatura: as enzimas de restrição são chamadas de acordo com a bactéria que a produziu:
Izosquizomeros: diferentes enzimas de restrição que possuem a mesma sequência de reconhecimento
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Extremidades: coesivas X “cegas”
-3’
coesiva = EcoRI =
“cega” = SmaI =
5’-CCCGGG-3’
3’-GGGCCC-5’
5’-CCC
3’-GGG
GGG-3’
CCC-5’
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Cortando e Juntando o DNA....
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Amplificação do DNA recombinante....
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Escolha de um vetor de clonagem:




molécula pequena – fácil manipulação
capaz de se replicar em uma célula viva
presença de sítios de restrição para inserção do DNA a ser clonado
possuir um método de identificaçãoe recuperação das moléculas recombinantes
Ex: pUC18
ampR - bactérias transformadas serão
resistêntes a ampicilina
popiligador – sítio de clonagem múltipla
lacZ’ - codifica para –galactosidade que
converte X-Gal em um corante azul
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Construção de uma biblioteca de DNA
Construção de uma biblioteca de cDNA
 cDNA = DNA complementar;
feito a partir do mRNA;
 não tem introns
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Uso do DNA clonado como sonda
 transferência de Southern (E.M. Southern) - DNA
 transferência de Northern- RNA
 transferência de Western - PTN
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Mapas de Restrição
É uma compilação do número, da ordem e da distância entre locais do corte da enzima de
restrição ao longo de um segmento de DNA
 As unidades do mapa são expressadas em pares de bases ou para distâncias
mais longas em pares de kilobases
 O DNA encontra-se, geralmente, dentro de um vetor bem caracterizado do
plasmídeo ou do bacteriófago, onde a sequência é conhecida
 Normalmente, o mapeamento é a primeira etapa para caracterizar um DNA
desconhecido e um pré-requisito para manipulá-lo para outras finalidades.
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