Transcript Produção de proteínas em bactérias

Graduação em Biotecnologia
Disciplina de Biotecnologia Microbiana II
Produção de proteínas em
bactérias
Prof. Fabricio Rochedo Conceição
[email protected]
06 de abril de 2010
DNA recombinante
Molécula de DNA produzida a partir da combinação de seqüências de
DNA provenientes de diferentes fontes.
Proteína recombinante
Proteína produzida a partir da expressão de uma molécula
de DNA recombinante em um sistema
de expressão adequado.
Por que produzir e purificar proteínas recombinantes?
 Estudos bioquímicos
 Determinação da estrutura 3D
 Aplicações biotecnológicas
- Terapia
- Vacinas
- Diagnóstico...
Alternativa para as seguintes limitações:
 Quantidade
 Dificuldade de purificação a partir do tecido original
 Contaminação (príons, vírus, oncogenes...)
 Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas
 Processo completamente controlado
 Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos
Mycoplasma hyopneumoniae
Pneumonia Micoplásmica Suína
Sistemas de expressão heteróloga
***Animais e plantas
Produção de proteínas
recombinantes em bactérias
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o organismo
mais estudado!
Engenharia genética X expressão
heteróloga
1. Obtenção do DNA a ser clonado
2. Preparo do vetor
3. Ligação do vetor com o “inserto”
4. Transformação da bactéria
5. Seleção dos clones recombinantes
Vetores de Expressão
• Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG
• Sítio de múltipla clonagem (polylinker)
• Promotores induzíveis (controle da expressão)
• Sinais de secreção
• Fusão com proteínas carreadoras (solubilidade e purificação)
pT7
6x His
Ava I (131)
BamHI (137)
Ava I (146)
EcoRI (171)
pUC ori
ApaLI (2338)
Vetor de expressão
em E. coli
HindIII (178)
f1 ori
pAE
2831 bp
ApaLI (1092)
AmpR
RBS ou sequência de
Shine Dalgarno
Regulação da expressão gênica –
controle da expressão
Operon Lac
Vetores da família pET (Novagen)
•
•
•
•
Altos níveis de expressão
Promotor T7 é mais forte que o lac
Controle rigoroso pelo lacO
Necessita de cepa de E. coli especial – BL21(DE3)
IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)
Extrato total proteico de bactérias separado em SDS-PAGE
não induzidas
Proteína
recombinante
de 70 kDa
induzidas com IPTG
Produção de proteínas recombinantes em bactérias
(sistema pET)
Vetor de expressão com cauda de histidina
Cromatografia de
afinidade – Ni-Sepharose
-Purificação de proteínas com
cauda de histidina (his-tag)
-Minimizar a proteólise
-Maximizar a expressão
-Minimizar “vazamento” de expressão (importante para expressão de proteínas tóxicas)
-Facilitar o folding
-Solubilidade
Algumas companhias que comercializam vetores de expressão
http://www.promega.com
http://www.neb.com
http://www.stratagene.com
http://www.invitrogen.com
Produção de insulina recombinante
(Humulin: Human insulin da Eli Lilley Corporation)
 Primeiro hormônio recombinante disponível comercialmente para humanos;
 Antes de ser disponibilizada comercialmente era extraída de pâncreas de animais;
 Atualmente a forma recombinante é a mais usada no tratamento do diabetes.
Estrutura e biossíntese da molécula de insulina humana
Seq sinal
Peptídeo C
Cadeia α
Preproinsulina
Clivagem da sequência sinal de secreção
Cadeia α
Ligações dissulfeto
Cadeia β
Cadeia β
Cadeia β
Peptídeo C
Cadeia α
Clivagem do peptídeo C
Insulina funcinal
Proinsulina
Obtenção de insulina
recombinante
Algumas proteínas recombinantes disponíveis
para terapia humana
 Insulina (rhI);
 Hormônio do crescimento (rhGH);
 Hormônio folículo estimulante (rhFSH);
 Fator VIII (rhFactorVIII);
 Eritropoetina (EPO);
 Fator estimulante de colônias de granulócitos (rhG-CSF);
 N-acetilgalactosamina-4-sulfatase (rhASB);
 DNAse
 Ativador do plasminogênio tecidual (rhTPA);
 Glicocerebrosidase (rhGBA);
 Interferon-alfa, -beta e gama (rhIFN-alpha, -beta e -gama);
 Fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1).
Vantagens e desvantagens do sistema de
expressão heteróloga em E. coli
Vantagens
Desvantagens
Genética e fisiologia bem conhecidas
Não faz certas modificações pós-traducionais
Enorme variedade de vetores disponíveis
Atividade biológica pode diferir da proteína natural
Fácil controle da expressão gênica
A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas
Facilidade de manutenção em laboratório
Falta de um mecanismo de secreção
Alta produção de proteínas heterólogas
Formação de corpos de inclusão
Trabalho complementar
* Formar grupos com 4 componentes
* Buscar no PubMed artigo científico relacionado a expressão de
proteína heteróloga em E. coli
* Entregar até 12-04-10
- Referência bibliográfica
- Descrição da proteína recombinante
- Aplicação da proteína recombinante
- Vetor utilizado para a expressão
- Características do vetor de expressão
- Estratégia de purificação da proteína recombinante
- Resultados relacionados a expressão da proteína recombinante