Transcript Tecnologia do DNA recombinante BIOLOGIA MOLECULAR FABIANA SEIXAS

BIOLOGIA MOLECULAR
Tecnologia
do DNA recombinante
FABIANA SEIXAS
email: [email protected]
ABORDAGENS...
1. DNA recombinante
2. Enzimas de restrição
3. Vetores de Clonagem
- Plasmídios
- Bacteriófagos
- Cosmídeos
4. Etapas de Clonagem Molecular
5. Aplicações
O que é um DNA recombinante?
- É uma molécula de DNA formada pela
ligação de duas moléculas de origens
diferentes (Ex. DNA de planta ligado a
um plasmídio)
DNA RECOMBINANTE
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Descritas em 1970,
W. Alber
H. Smith
D. Nathans
• Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é
um tipo de nuclease que cliva uma fita dupla de DNA
sempre que identificar uma seqüência particular de
nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima;
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Função Natural: proteger o DNA
bacteriano do DNA exógeno
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
A enzima BamHI reconhece a seqüência dupla fita:
BamHI
- reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA palíndromos, atuando como verdadeiras tesouras moleculares
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Nomenclatura
• BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H
5’ G/GATCC 3’
• EcoRI - Escherichia coli R
5’ G/AATTC 3’
• HaeIII - Haemophilus aegyptius
5’ GG/CC 3’
• PstI - Providencia stuartii
5’ CTGCA/G 3’
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
370 C, 1 hora,
com tampão
adequado
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
Tipos de cortes:
- Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes)
- Produção de terminais abruptos (ou cegos)
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO
181
NarI
~~~~~~
ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC
TGGTATACGC CACACTTTAT GGCGTGTCTA CGCATTCCTC TTTTATGGCG TAGTCCGCGG
241
ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT
TAAGCGGTAA GTCCGACGCG TTGACAACCC TTCCCGCTAG CCACGCCCGG AGAAGCGATA
301
TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT
ATGCGGTCGA CCGCTTTCCC CCTACACGAC GTTCCGCTAA TTCAACCCAT TGCGGTCCCA
361
421
HindIII
PstI
~~~~~~~
~~~~~~
TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTGCATGC CTGCAGGTCG
AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAACGTACG GACGTCCAGC
XbaI BamHI
KpnI
EcoRI
~~~~~~~~~~~~~
~~~~~~~
~~~~~~~
ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG AATTCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT
TGAGATCTCC TAGGGGCCCA TGGCTCGAGC TTAAGCATTA GTACCAGTAT CGACAAAGGA
TIPOS DE VETORES
TIPOS DE VETORES
Vetores
Plasmídeos
Cosmídeos
Bacteriófagos
Hospedeiros
Bactérias / leveduras
Utilização
clonagem
VETORES PLASMIDIAIS
• Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita
dupla,
extracromossômico,
que
ocorrem
naturalmente em bactérias e algumas leveduras
– pUC18
– pBR322
– pUP310
Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de até 9kb
VETORES PLASMIDIAIS
Vetor de Expressão em
Procarioto
rCanamicina
oriE
HindIII
XbaI
pUS974
4039 pb
RBS
hsp60
oriM
MT19
VETORES PLASMIDIAIS
Promotor CMV
rAmpicilina
Intron
EcoRI (1251)
pTarget
5670 bp
BamHI (1257)
EcoRI (1319)
HindIII (1326)
Poly A
rNeomicina
Vetor de Expressão em
Eucariotos
Vacina Vetorizada (rBCG)
rCanamicina
rCanamicina
oriE
oriE
pUS973
3984 bp
HindIII
XbaI
HindIII
XbaI
pUS974
4039 pb
RBS
RBS
hsp60
oriM
Promotor hsp60
oriM
MT19
rCanamicina
Kan(R)
oriC
oriE
pUS977
3984 bp
pUS2000
HindIII
XbaI
RBS
HindIII
3759pb
XbaI
oriM
Promotor pAN
p18kDa
OriM
VETORES PLASMIDIAIS
Vetor de Expressão em
Eucariotos
BACTERIÓFAGO
- Vírus
que infectam bactérias;
- DNA ou RNA;
- Capsídeo
- Biologia do fago
- Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a
25 kb
BACTERIÓFAGO
Ciclo Lítico
Ciclo
Lisogênico
COSMÍDEOS
-São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos;
- Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35
kb;
VETORES DE CLONAGEM
• Replicação autônoma
• Marcador de seleção (antibiótico)
• Sítio único de clonagem
VETORES DE EXPRESSÃO
• Necessitam de um promotor forte, de
um RBS e de ATG
• Promotores induzíveis
• Sinais de secreção
• Fusão com proteínas carreadoras
CLONAGEM MOLECULAR
CLONAGEM MOLECULAR
• É o isolamento e a
propagação
em
um
organismo de moléculas
idênticas de DNA
CONSTRUÇÃO DE UM MICRORGANISMO
RECOMBINANTE
1. Obtenção do DNA a ser clonado
2. Preparação do vetor
3. Ligação do vetor com o “inserto”
4. Transformação da bactéria
5. Seleção dos clones recombinantes
1.Obtenção do DNA a ser clonado
-
Extração de DNA;
PCR
Digestão
Purificação
1.Obtenção do DNA a ser clonado
PCR
94 0C por 5 min
94 0C por 1 min
55 0C por 1 min
72 0C por 1 min
72 0C por 5 min
4 0C
35 ciclos
Eletroforese em gel de agarose
Visualização do DNA em luz
ultravioleta
3.Preparação do vetor
• Digestão
• Purificação
Plasmídeo Circular
Plasmídeo linear
Digestão com
Enzimas de
restrição
4. Ligação
Extremidades coesivas
Fragmento
de DNA inserto
LIGASE
DNA
plasmidial vetor
5.Transformação da bactéria
5.Transformação da bactéria
ELETROPORAÇÃO
5.Transformação da bactéria
6.Seleção dos clones recombinantes
Construção do DNA Recombinante
Molécula de DNA de
um plasmídeo circular
Molécula de DNA de um plasmídeo
linear com extremidades coesivas
anelamento
Clivagem com
enzima de
restrição
Ligação covalente
pela DNA ligase
Inserção em
uma célula
hospedeira
Molécula de DNA
plasmidial contendo
o inserto
Extração de DNA de L. interrogans
Leptospira interrogans
meio EMJH
Extração de DNA
PCR
94ºC – 5 min
94ºC – 1 min
50ºC – 1 min
72ºC – 1 min
72ºC – 7 min
Primer F
Primer R
30 ciclos
lipL32
768 pb
Construção dos Vetores
PCR
Clonagem em Vetores
de expressão
Transformação E.coli
Seleção dos Clones
recombinantes
lipL32
768 pb
Triagem
Digestão
Extração
768 pb
Expressão de Proteínas Recombinantes
Promotor T7
XbaI (59)
6X His
BamHI (137)
HindIII (178)
Transformação da
E.coli
oriE
pAE
f1 ori
2831 bp
rAmpicilina
Cultura de
Células
Purificação da
Proteína
Purificação de proteínas recombinantes
Ligação
pT7
Xba I (59)
6x His
pUC ori
Xho I (131)
Bam H I (468)
Transformação por
Eletroporação
Extração de DNA
plasmidial
LipL32
pAE/LipL32
Eco R I (887)
3547 bp
Hin d III (894)
E. Coli DH5
AmpR
f1 ori
pLysS
Transformação por Choque
Térmico
E. coli (BL21)
codon pluss
SI
DE3
Cepas de E.coli para
expressão de proteínas
SDS-PAGE (Eletroforese de proteínas)
SDS-PAGE
Expressão de Proteínas Recombinantes
Expressão em diferentes cepas de E.coli
Purificação de Proteínas Recombinantes
Akta Prime
Gel de poliacrilamida 15%.
1
2
3
4
30kDa
1.
BENCHMARKTM Protein Ladder em
kDa
2, 3 e 4. LipL32 purificada (eluições).
APLICAÇÕES
VACINAS RECOMBINANTES
P RIME R F
1. PCR
Xba I (4)
P rimer R
Bam HI (342)
HindIII (761)
LipL32 0906
lipL32
768 bp
L. interrogans
lipL32
2. Clonagens
pAE
3. Multiplicação
pTARGET
E.coli (BL21)
Vetor
Plasmidial
Vetor
Plasmidial
pUS973
pUS974
pUS977
Vetor
Plasmidial
E.coli TOP10
Vetor
Plasmidial
Vetor
Plasmidial
E.coli TOP10
Vetor
Plasmidial
Vetor
Plasmidial
Vetor
Plasmidial
Vetor
Plasmidial
Vetor
Plasmidial
Vetor
Plasmidial
Vetor
Plasmidial
4. Vacinação
Vetor
Plasmidi
al
Vetor
Plasmidi
al
Vetor
Plasmidi
al
Proteína Recombinante
Vacina de DNA
Vetor
Plasmidi
al
Vetor
Plasmidi
al
Vetor
Plasmidi
al
Vetor
Plasmidi
al
Vetor
Plasmidi
al
Vetor
Plasmidi
al
Vetor
Plasmidi
al
Vetor
Plasmidi
al
Vetor
Plasmidi
al
BCGr
Vetor
Plasmidial
Vetor
Plasmidial
Vetor
Plasmidial
ANIMAIS TRANSGÊNICOS
PLANTAS TRANSGÊNICAS
FIM???