Transcript Marcio Alvarez SAF

Ilíada Rainha de Souza - UFSC
Avaliação de procedimentos terapêuticos na
utilização de células tronco mesenquimais no
Acidente Vascular Cerebral
Coordenador: Marcio Alvarez Silva
Equipe: Andrea Gonçalves Trentin, Maristela Maria Martini,
Juçara Loli de Oliveira, Marcos dos Anjos, Diego Amarante
da Silva
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Objetivo
Obter e amplificar ex vivo CTMs humanas de
placenta obtidos de neonatos a termo, assim
como obter, caracterizar e reprogramar as
CTMs obtidas para o fenótipo neural. Este
ponto é importante para comparar a
metodologia de utilização de enxerto de CTMs
obtidas da placenta, no tratamento para AVC
associando CTMs com a terapêutica de
reabilitação hospitalar pós AVC.
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Objetivos específicos
1. Estabelecimento de um modelo experimental de lesão isquêmica para avaliação de enxertos.
2. Investigar os padrões de neuroproteção, neurogênese e recuperação funcional de animais
isquêmicos transplantados com células-tronco da placenta e, ao mesmo tempo, submetidos
ao bloqueio da ativação microglial pela minociclina.
3. Avaliar forma qualitativa e quantitativa a evolução do processo neurodegenerativo após
isquemia.
4. Investigar os efeitos do enxerto de células-tronco da placenta sobre os padrões
histopatológicos de animais isquêmicos, utilizando parâmetros incluindo área de lesão,
número de neurônios adultos e recém formados (neurogênese), axônios lesados, corpos de
oligodendrócitos e células apoptóticas.
5. Estudar as melhores condições para a amplificação de CTMs in vitro, para geração de uma
matriz competente de larga utilização para utilização na regeneração de lesão cerebral.
6. Avaliar a expressão de fatores de transcrição importantes em manter o estado indiferenciado
das CTMs, como indicador de pluripotencialidade: oct3/4, Rex1, Nanog, FoxD2, Sox2.
7. Avaliar os custos específicos para a implantação da metodologia em Centros de Terapia
Celular (CTCs), a ser implantada nas Unidades Terapêuticas vinculas ao SUS.
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Metodologia
Obtenção de CTMs derivada de placenta:
Em associação com HU/UFSC obtivemos a
placenta de recém- natos a termo, as células
são obtidas por dissociação mecânica e
enzimática.
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Metodologia
Citometria de Fluxo: Através do ensaio de
citometria de fluxo, avaliamos a expressão de
marcadores de superfície específicos pelas
CTMs isoladas
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Metodologia
Diferenciação in vitro das CTMs: analisamos
a potencialidade de CTMs, como controle de
qualidade da preparação, através de
diferenciação celular, pela adição de fatores
descritos para diferenciação de células
progenitores multipotentes humanas de
medula.
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Metodologia
Transfecção do plasmídeo EGFP em CTMs
Os plasmídeos GFP foram transfectados nas
CTMs quando apresentarem em torno de 8090% confluentes, através da diferentes
metodologias.
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Metodologia
Modelo experimental de isquemia:
Camundongos C57/BL6 adultos foram
anestesiados e submetidos a isquemia
cerebral, por eletrocauterização de um ramo
distal da artéria cerebral média.
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Metodologia
Análise imunocitoquímica e fenotípica: Os
cortes histológicos preparados 30 e 60 dias
após o enxerto serão fixadas com
paraformaldeído 4% durante 30 minutos em
temperatura ambiente, sendo lavadas
posteriormente com PBS. O material foi
submetido a avaliação histopatológica.
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Metodologia
Avaliação motora: após o 1° e 3º dia da lesão
isquêmica, e posteriormente no 7º, 14° e 21°,
seguindo a escala de Basso, Beattie e
Bresnahan (BBB), preconizada pela Ohio State
University (OSU), que envolve a observação e
o escore de 10 comportamentos incluindo
tórax, cauda e as patas traseiras direita e
esquerda.
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Metodologia
Reação de polimerase em cadeia via
transcriptase reversa (RT-PCR): As culturas
foram preparadas e após 4 dias analisadas
quanto a expressão de diferentes proteínas
através da extração de RNA total para ensaios
de RT-PCR. O RNA total destas amostras
foram purificados utilizando reagente
TRIZOLTM. A fita de DNA complementar (cDNA)
será sintetizada para as analises.
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Resultados e Discussão
As células em cultura
foram mantidas em IMDM
com 10% SBF.
O tecido foi dissociado
mecanicamente com
pancreatina
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Resultados e Discussão
Plasticidade de células-tronco mesenquimais
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Plasticidade de células-tronco mesenquimais
(A) morfologia celular fibroblastóide: (B) diferenciação celular
para adipócitos e (C) diferenciação celular em osteócitos.
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Resultados e Discussão
CD 45 FITC
CD 73 PE
CD 105 PerCP
CD 90 FITC
Imunofenotipagem de
células-tronco
mesenquimais: baixa
expressão de CD45 (0,6%)
e expressão de CD73
(75%), CD90 (66,5%) e
CD105 (62%).
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Resultados e Discussão: Expressão de Nanog e Oct-4
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Resultados e Discussão
CTMs foram co-cultivadas com as culturas mistas de
cerebelo de camundongos
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Resultados e Discussão
Caracterização de culturas mistas
realizadas através do cerebelo
(A, C, E) e córtex (B, D, F)de
camundongos. B-tubulina III (A,
B),GFAP (C,D) e NeuN (E,F).
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Resultados e Discussão
Expressão de marcadores
imunofenotípicos das CTMs
quando co-cultivadas com
culturas mistas de cerebelo (A,C
e E), e córtex (B,D e F) . As
CTMs expressaram marcadores
como B-tubulina III (A, B), GFAP
(C,D) e Nestina (E,F).
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Cerebelo
A B-Tubulina III
B- Nestina
C- GFAP
D- Nanog
E- GAPDH,
Cortex
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Lesão isquêmica experimental
na região cortical do cérebro
de camundongo (B, D).
Cortex controle (A, C).
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Transfecção de CTMs com o
gene EGFP para enxerto em
modelo experimental de lesão
isquêmica.
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Infiltração de CTMs marcadas na área da lesão
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Avaliação motora, em
andamento
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Impactos do Projeto – Científico
Esperamos ao termino deste Projeto, ter um panorama da
expressão de fatores de transcrição na seleção de CTMs
com alto potencial de neuroplasticidade. Neste trabalho
classificaremos a melhor combinação entre a expressão
de fatores de transcrição (oct3/4, Rex1, Nanog, FoxD2,
Sox2). Um ponto importante é o controle na expressão
destes fatores de transcrição em CTMs diferenciadas ou
em um nicho neuronal.
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Aplicabilidade para o SUS
• Determinação da melhor condição de cultura para a
amplificação ex vivo de células tronco mesenquimais,
estabelecendo um protocolo, para aumentar a
possibilidade do sucesso terapêutico.
• Definir protocolos para amplificação e reprogramação
fenotípica de CTMs.
• Determinação da melhor condição de cultura para a
amplificação ex vivo de células tronco mesenquimais,
estabelecendo um protocolo, para aumentar a
possibilidade do sucesso terapêutico.
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Aplicabilidade para o SUS
• Aproveitamento racional de tecidos ricos em CTMs para
utilização clinica.
• A determinação dos custos para implantação da técnica do
enxerto no SUS, assim como sua viabilidade para atender
um maior numero de pacientes.
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Produção Científica
Anais de congresso:
1. MARTINI, Maristela Maria, MAROSTICA, L. L., TRENTIN, Andréa Gonçalves, ALVAREZ-SILVA, Marcio. A influencia
do microambiente na diferenciação de células tronco mesenquimais de placenta humana In: V Congresso Brasileiro
de Células-Tronco e Terapia Celular, 2010, Gramado. Anais de Congresso. , 2010. p.160 - 160
2. KOHLER, M. C., TRENTIN, Andréa Gonçalves, ALVAREZ-SILVA, Marcio. Avaliação da expressão dos genes NEPH
em células tronco mesenquimais obtidas de placenta humana In: V Congresso Brasileiro de Células-Tronco e Terapia
Celular, 2010, Gramado. Anais de Congresso. , 2010. p.87 - 87
3. MAROSTICA, L. L., VITURI, C. L., MARTINI, Maristela Maria, TRENTIN, Andréa Gonçalves, ALVAREZ-SILVA,
Marcio. Influencia do meislato de imatinibe na proliferação in vitro das células tronco mesenquimais de placenta
humana In: V Congresso Brasileiro de Células-Tronco e Terapia Celular, 2010, Gramado. Anais de Congresso. ,
2010. p.159 – 159.
Artigos em fase final de preparação:
1. Maristela Maria Martini, Talita da Silva Jeremias, Maria Cecília Kohler, Rossana Simão, Andréa Gonçalves Trentin
and Marcio Alvarez-Silva *. Human placenta-derived mesenchymal stem cells acquire neural phenotype under
appropriate niche conditions, para submissão na DNA AND CELL BIOLOGY.
2. Maria Cecilia Kohlera;b, Talita da Silva Jeremiasb, Maristela Maria Martinib, Rosana Simãob, Andréa Gonçalves
Trentinb, Marcio Alvarez-Silvab*. Human placenta-derived mesenchymal stem cells achieve neural morphology
with inductive chemical medium. Para submissão na Experimental Neurology.
3. Lucas L. Marostica1, Cidônia de Lourdes Vituri2, Andréa G. Trentin1, Marcio Alvarez-Silva1+. Effects of Imatinib
Mesylate in culture of mesenchymal stem cells derived from human placenta. Para submissão no Anti-Cancer
Drugs.
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Considerações Finais
A formação de recursos humanos e um dos objetivos de nossa Proposta.
Temos em andamento as seguintes orientações vinculadas a este Projeto de Pesquisa:
Dissertações de mestrado
1. DIANA HECK. AVALIAÇÃO DA PROLIFERAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO ÓSSEA DE CÉLULAS TRONCO DE PLACENTA
HUMANA EM ARCABOUÇO HIDROGEL. 2010. Dissertação (Biologia Celular e do Desenvolvimento) - Universidade Federal
de Santa Catarina
2. Diego Amarante da Silva. Avaliação de recursos terapêuticos em Acidente Vascular Cerebral. 2009. Dissertação (Biologia
Celular e do Desenvolvimento) - Universidade Federal de Santa Catarina
Teses de doutorado
1. Rogerio Gargioni. Avaliação do nicho molecular de células tronco hematopoéticas e mesenquimais em placenta
humana. 2009. Tese (Biologia Celular e do Desenvolvimento) - Universidade Federal de Santa Catarina
2. Maristela Maria Martini. Diferenciação de células tronco mesenquimais humanas para o fenótipo neural: efeitos do
nicho encefálico. 2009. Tese (Neurociências) - Universidade Federal de Santa Catarina
3. Juçara Loli de Oliveira. Estudo de Células Tronco de Placenta Humana Aplicadas em Lesões decorrentes de Isquemia
Cerebral em Camundongos. 2009. Tese (Biologia Celular e do Desenvolvimento) - Universidade Federal de Santa Catarina
4.
Aloiso Luiz Benedetti. Uso de células tronco mesenquimais para amplifcação ex vivo de células tronco hematopoéticas.
2009. Tese (Farmácia) - Universidade Federal de Santa Catarina
Iniciação científica
1. Mariane Dahmer. Avaliação de procedimentos terapêuticos na utilização de células tronco mesenquimais no Acidente
Vascular Cerebral. 2010. Iniciação científica (Bacharel em Ciencias Biologicas) - Universidade Federal de Santa Catarina
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