Clonage Moléculaire
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Transcript Clonage Moléculaire
Clonage Moléculaire
Définitions
Clonage :
Sous-clonage:
Transfère d’une insertion d’ADN cloné ou une partie de
ce dernier d’un vecteur à un autre vecteur
Plasmide recombinant:
Obtenir un morceau d’ADN à partir de la source originale
(Génome) et l’introduire dans un vecteur d’ADN
Vecteur dans lequel un ADN étranger a été introduit
Organisme recombinant
Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été
introduit
Pourquoi cloner?
Séparer,
identifier, manipuler ou
exprimer un fragment spécifique d’ADN
3
Étape 1- Séparer
Deux
approches:
Fragmenter/digérer
l’ADN génomique
Génère
un très grand nombre de fragments
Peut-être difficile de retrouver le fragment
d’intérêt
Amplification
Beaucoup
par PCR
moins de fragments
Beaucoup plus facile de retrouver la séquence
d’intérêt
Cloner
Enzyme de
restriction
Vecteur
approprié
Ligature Intermoléculaire
Recombinant
Cellules Hôte
Enzyme de
restriction
Générer des extrémités
compatibles
Fragment
d’intérêt
Ligature
d’ADN
Ligature Intramoléculaire
Non-Recombinant
Transformation
Cellule Recombinante Cellule Non-Recombinante
1 plasmide/1 cellule
Amplification des Plasmides Recombinants
1 colonie= 1 clone avec 1 plasmide + 1 insert
Duplication
de plasmide
Croissance bactérienne
Criblage et Identification de Clones
Recombinants Plasmidiques
Cartographie
Hybridation
PCR
de restriction
Expression
Pourquoi?
Produire
la protéine dans un système
hétérologue
Produire la protéine en grande quantité
Purifier la protéine
Étudier l’activité de la protéine
Amplification, Mutagenèse, Clonage &
Expression de LacZ– Projet II
Partie
I
Amplification
LacZ
Partie
II
Clonage
Partie
Esai
& mutagenèse par PCR du gène
de LacZ dans pUC19
III
enzymatique des protéines
recombinantes
Purification & Digestion de l’ Amplicon Mel 1
Purification
Permet
par QiaQuick
de retirer le tampon, sels, etc.
Permet de retirer les amorces
Permet de retirer l’enzyme
Digestion
de restriction BamHI et EcoRI ont été
ajoutés à la séquence de l’amplicon
Sites
Absent
dans la séquence de Mel 1
Présent dans le site de clonage multiple du
vecteur d’expression (pRS424)
Permet le clonage dirigé