Projet I

Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN

Objectifs

 Déterminer quel gène vous avez (Bioinfo)  Générer une carte théorique (Bioinfo)  Vérifier expérimentalement la carte  Déterminer l’orientation

Cartographie des plasmides inconnus  Vecteur pUC19

Clonage dans pUC19

SCM

Digéré avec X

Clonage dans pUC19

+

Insertion

Déterminer le site d’insertion

Couper avec X

+

Insertion

X Delimites la droite & la gauche Ex. Si Pst est le site d’insertion: Bam est à la gauche Si Xba est le site d’insertion, alors Bam est à la droite

Déterminer l’orientation relative

Orientation 1

A X A X

Orientation 2

A X A X

Projet II

Mutagenèse dirigée de LacZ

Objectifs

 Utiliser le PCR pour faire l’amplification et la mutagenèse du gène Lacz dans pUC19  Utiliser le PCR pour ajouter des sites de restrictions appropriés aux extrémités du gène LacZ pour permettre le clonage

Réplication & Amplification d’ADN

La Réaction de la Polymérase en Chaîne

Polymérases

Amorce Extrémité 3’OH 5’…GTACT -OH 3’…CATGAATGCTGCATTTGCGGGCATTACTC…5’ Matrice d’ADN ou ARN

2 Types de Polymérases ADN:

 ADN dépendante :  Requiert une matrice ADN  Fait la synthèse d’ADN  Ex. Polymérase Taq  ARN dépendante  Requiert une matrice ARN  Fait la synthèse d’ADN (ADNc)  Ex. Transcriptase inverse

La Réaction de la Polymérase en Chaîne-PCR

 Réplication répétitive d’une région donnée d’ADN  Permet l’amplification exponentielle d’une région donnée d’ADN  Augmente la représentation relative d’une région d’intérêt  Permet l’isolation d’une région donnée d’ADN 14

PCR-1

ier

Cycle

5’ 3’ 3’ 5’ Dénaturation (95 o C) 5’ 3’ 3’ 5’ Appariement des amorces (Tm) <3’GGAACGGTACCGT5’ 5’CATACCGTGGGGTGCA ………..

ACGCGTTGCGATGGCA3’ 3’GTATGGCACCCCACGA ………..

TGCGCAACGCTACCGT5’ 5’CCGTGGGGT3’>

Extension (72 o C) 5’ <3’GGAACGGTACCGT5’  ………..

------------------------------- ACGCGTTGCGATGGCA3’ 3’GTATGGCACCCCACGA --------------------------------- ………..

 TGCGCAACGCTACCGT5’ 5’CCGTGGGGT3’> 16

PCR-2

e 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ ----------------- --------------------- 

Cycle

5’ --------------------- ------------ ----------- ------------------------------------- 5’ 3’ 3’ 5’ Dénaturation 3’ ----------- ---------------------  Appariement -- 5’ ----------- /Extension ------------------------------------- 3’ ----------- -- --------- -- 5’ 5’

PCR- Cycles Subséquents

--- --------------- --------------- -- --- --------------- --- --- --------------- --- Seulement cette matrice est amplifiée de façon exponentielle : 2 n fois --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- --- --------------- --- 32 fois totale

Survol des Cycles du PCR

 Amorces:  Courte séquence de nucléotidiques simple brins complémentaires aux cibles  15-30 nucléotides  Utilisée en excès comparativement à la cible afin de favoriser l’appariement des amorces plutôt que l’appariement des matrices

Survol des Cycles du PCR

 Appariement:  Température à laquelle les amorces s’apparient aux séquences complémentaires  Dois être sous le Tm des amorces  Dois être une température qui permet aux deux amorces de s’apparier  Habituellement entre 55-75 o C

Survol des Cycles du PCR

 Extension:  Fait à la température optimale pour la polymérase ADN  Habituellement 72-75 o C pour la polymérase Taq

Polymérase Taq

 Isolé d’une bactérie thermophile  Thermus aquaticus  Stable à des températures élevées  95 o C - utilisée pour dénaturer l’ADN  Aucune activité exonucléase  Pas d’autocorrection  Possède une activité deoxynucléotidyl transférase  Activité polymérase indépendante d’une matrice  Ajoute dA aux extrémité 3’OH libres

Amorces

 Caractéristiques:  Courts oligonucléotides complémentaires aux séquences qui bordent la région d’intérêt  Établis le point d’initiation de la réplication  Établis le point de terminaison de la réplication 23

Conception d’Amorces

Autocomplémentarité: 5’GGGGCCCC3’ G G G G C C C C Complémentarité de la paire 5’GGGGAAAA3’ 3’CCCC TTTT5’ 24

Conception d’Amorces

Complémentarité 5’ CCATAACCGG-OH3’ Complémentarité 3’ Matrice 3’…………….ATGGGTATTGGCC…………………..-5’ TACCCATAACC 25

Conception d’Amorces

5’ 3’ Région d’intérêt 3’ 3’ 3’ Région d’intérêt Bonne orientation Mauvaise orientation 3’ 3’ 5’ 26

Problème

5’-AAAAAAAAAAAA  GGGGGGGGGGGGG-3’ Vous désirez amplifier la séquence représentée par la boite. Quelle paire d’amorces est dans la bonne orientation pour accomplir ceci?

1- AAAAAA 2- TTTTTT 3- GGGGGG 4- CCCCCC 27

Utilité du PCR

 Amplification et isolation d’une région donnée en changeant sa représentation relative  Entre 100pb et 10Kpb  Criblage pour déterminer la présence d’une séquence d’intérêt  Présence ou absence d’un produit d’amplification  Mutagenèse dirigée  Utilisé pour ajouter ou enlever des nucléotides sur la matrice originale 28