Transcript La PCR - Collège Lionel

La PCR
• Applications en santé
animale (aperçu)
• Voir l’ADN :
l’électrophorèse
• But de la PCR
• Comment ça marche?
• Comment procéder?
• Quelques exemples
Julie Lavoie,
enseignante au Collège Lionel-Groulx
PCR : de nombreuses
applications en santé animale
• Diagnostic de maladies infectieuses
• Détection d’allèles récessifs chez des
hétérozygotes
• Génotypage d’animaux de laboratoire
• Sexage animal
• Tests de filiation
Voir l’ADN : l’électrophorèse
• L’ADN : observation
directe impossible
• Y accrocher des
molécules* qui
s’illuminent aux UV
• Grande quantité
d’ADN… mais quel
ADN?
*Des molécules qui s’accrochent à l’ADN et qui
s’illuminent aux UV :
–Le bromure d’éthydium (EtBr)
–Le Vistra Green
–Le SYBR Green
Ces produits doivent être utilisés avec des précautions
extrêmes (on sait notamment que le bromure d’éthydium est un
mutagène extrêmement puissant)
Électrophorèse – animation :
Pour accéder au site, cliquez ICI ou lien sur page web EDC.
Sur le site, choisir successivement : 1-Manipulation
2-Techniques
3-Sorting and sequencing
4-Gel electrophoresis : animation 2D
But de la technique PCR
• Amplifier un segment d’ADN d’intérêt**
afin de pouvoir le visualiser (en électrophorèse)
**Des segments d’ADN d’intérêt (1/3) :
• Pour dépister un agent infectieux, amplifier un segment
spécifique au génome du pathogène recherché, par ex.:
• virus (ex.: ADN du Coronavirus entérique félin « PIF »)
• bactéries (ex.: ADN de Chlamydia)
• parasites (ex.: ADN du Ver du cœur canin)
• Pour déceler un allèle récessif, amplifier un segment
spécifique à l’allèle récessif causant la maladie, par ex.:
• ex.: Syndrome du porc stressé « PSS »
Suite…
**Des segments d’ADN d’intérêt (2/3) :
• Pour tester le génotype d’un animal de laboratoire,
amplifier un segments correspondant à la particularité
génétique à contrôler pour cet animal, par ex.:
• Un gène inactivé (knock-out) ou un gène ajouté dans un
animal transgénique
• Pour sexer un animal, amplifier des segments spécifiques
aux chromosomes sexuels, donc :
• Des gènes situés uniquement sur le chromosome X, sur le
Y, sur le Z ou sur le W
Suite…
**Des segments d’ADN d’intérêt (3/3) :
• Pour établir la parenté (ex.: test de paternité)
ou l’identité d’un individu (ex.: domaine judiciaire),
amplifier plusieurs segments d’ADN non codant
très polymorphes (hypervariables) entre individus,
par exemple les microsatellites.
Pour chacun de ces segments, chaque individu possède
deux allèles parmi des dizaines possibles.
Le résultat d’ensemble est donc unique pour chaque individu.
La PCR : comment ça marche?
(1/3)
• Imite « in vitro » la réplication de l’ADN***, mais
seulement pour un segment d’ADN bien précis
• On utilise une enzyme, la Taq polymérase, qui est
une ADN polymérase thermorésistante ;
(cette enzyme a été isolée chez une bactérie vivant dans les
sources thermales du Parc Yellowstone!)
• PCR : polymerase chain reaction
ou ACP : amplification en chaîne par la polymérase
***La réplication de l’ADN
« in vivo » (rappel) :
• Les nucléotides « libres » s’unissent aux
brins d’ADN «exposés», par
complémentarité de leurs bases azotées :
(A – T ) (C – G)
• Le travail (ouverture de la double hélice,
assemblage des nucléotides ajoutés et
fermeture des deux doubles hélices) est
effectué par une équipe d’enzymes dont
l’ADN polymérase.
• Réf. pour plus de détails : Lien/animation
et Tortora et al. (2002) p. 137
La PCR : comment ça marche?
(2/3)
• L’ensemble des ingrédients est mis dans un microtube :
– Extrait d’ADN
– Amorces (« primers ») spécifiques à la région à
amplifier
– Taq polymérase et tampon de réaction
– dNTP (nucléotides, portant les bases A, C, G et T)
– H2O stérile
• TOUT doit être fait pour éviter de contaminer les
échantillons à analyser : stérilité du matériel et des
solutions, travail en asepsie, etc.
La PCR : comment ça marche?
(3/3)
• Le microtube est mis dans un thermocycleur
(machine à PCR) et subit une série de cycles au
cours desquels la température varie.
• Animation :
• http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm
Liens vers une autre animation sur la PCR : voir Médiagraphie ou
page web EDC
La PCR : comment procéder? (1/2)
1°) Prélevement d’un échantillon contenant de
l’ADN :
• Recherche d’un pathogène dans un animal malade ou
mort : prélèvement sanguin ou de viscères, car l’ADN du
pathogène peut être détecté dans les tissus de l’animal
(sang, foie, cerveau)…
• Analyse des gènes de l’animal (pour déterminer son
sexe, son espèce, ses allèles…) : prélèvement sanguin,
cutané (buccal), de poils ou de plumes, ou même parfois
ses fèces (excréments).
*Important : Bien identifier l’échantillon et indiquer quel test est
à effectuer, car les amorces diffèrent pour chaque test.
La PCR : comment procéder? (2/2)
2°) Extraction d’ADN à partir de l’échantillon
Après cette étape, le microtube d’extrait contient tout l’ADN
contenu dans l’échantillon : celui de l’animal tout comme celui
des pathogènes présents dans les tissus prélevés.
3°) Amplification par PCR
Après cette étape, le microtube à PCR contient des millions de
copies du segment d’ADN recherché, celui auxquelles les
amorces utilisées sont spécifiques.
4°) Visualisation des résultats par électrophorèse
5°) Interprétation du résultat
Exemple : Sexage d’oiseaux
1
2
3
4
5
6
7
• De gauche à droite :
• Puits #1 =
un standard, donc un mélange de fragments d’ADN de
tailles connues, utilisés comme repères pour déterminer la taille des
fragments obtenus par PCR
• Les puits #2 et 3 =
ADN de deux individus de sexe…
• Les puits #4 à 7 =
ADN de quatre individus de sexe…
Médiagraphie
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Sources des images :
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Thermocycleur : www.vignovin.com
Modèle moléculaire de l’ADN :
http://www.futura-sciences.com/news-100-milliards-bases-banques-donnees-adn-arn_6997.php
Gel - sexage d’oiseaux : http://www.lavoliere.com/elevage/adn/adn_03.htm
Électrophorèse aux UV : http://www.mediscan.co.uk/cfm/resultssearch.cfm?box=DN&mediatype=image&log=nk
Réplication de l’ADN : http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Dna-split.png
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Sites pertinents :
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Informations sur différents tests PCR disponibles en santé animale :
•
Lien vers l’animation sur la PCR :
http://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm
•
Lien vers 3 images « fixes » tirées de l’animation précédente, avec courts textes :
http://alexandre.alapetite.net/iup-gmi/cbgp/annexes.html#amplification
•
Lien vers une autre animation sur la PCR :
http://www.dnai.org/index.htm une fois sur le site, choisir : Manipulation ; Techniques ; Amplifying
Dans le même site est disponible également une animation sur le séquençage (dont la réaction est très
semblable à celle de la PCR). Il est donc intéressant de comparer les deux dans ce même site.
•
Lien vers une animation sur la réplication de l’ADN « in vivo » et les enzymes impliquées :
http://www.colvir.net/prof/chantal.proulx/animations/Replication-ADN.html