Cours M1 - 2012

Introduction aux techniques de biologie moléculaire

Expression des gènes Analyse des ARNm ADN ARNm Protéine Analyse des protéines

Analyse des interactions protéines/ADN ADN ARNm Protéine Analyse des interactions protéines/protéines Analyse des protéines Expression des gènes Analyse des ARNm

Expression des protéines

 Western-blot  Immunoprécipitation  Immunocytochimie  ELISA

Expression des protéines

Western-blot

Principe:  Séparation des protéines selon leur poids moléculaire  Immunodétection de la protéine d’intérêt Étapes:  Extraction et préparation des protéines des échantillons biologiques (dosage de protéine)  Migration et transfert sur membrane  Immunodétection

Dosage des protéines: pourquoi ?

Échantillons différents: Conditions différentes:

foie, cœur, poumon, rein, etc…

-

témoin, - traitement inducteur ou inhibiteur

 Expression différente de la protéine d’intérêt Uniformisation des échantillons Même quantité de protéines analysée quelque soit l’origine de l’échantillon ou le traitement reçu Dosage des protéines

Préparation des échantillons

Protéines: grande hétérogénéité de poids, charges et formes Contrecarrer ces effets  + + H 2 N COOH Différenciation sur 1 seul paramètre Ebullition  dénaturation + + Détergent anionique lipophile (SDS)  charges négatives  solvatation + empêche précipitation H 2 N H 2 N

-

-

-

+ + + COOH

-

+

-

-

-

+

-

-

-

+

-

COOH Composant sulfhydryl ( β-mercaptoéthanol, DTT)  empêche régénération des ponts disulfures Glycérol  augmente densité échantillon H 2 N

-

COOH Solution tampon (Laemmli )   Protéines dépliées et uniformément chargées (Fct masse) Migration en fonction du poids moléculaire (+ petite, + vite)

Western-blot

Immunodétection



Blocage des sites aspécifiques



Incubation avec Anticorps primaires



Incubation avec Anticorps secondaires



Révélation

Western-blot

Blocage de la membrane

 Blocage des sites aspécifiques: Protéines de lait (solution de lait à 5% dans tampon TBS-Tween) - BSA (Bovine Serum Albumin – 3-5% dans tampon TBS-Tween) Blocage avec des protéines inertes

X X X X

Membrane

Western-blot

Incubation avec Anticorps primaires

 Anticorps primaires = dirigé contre un épitope de la protéine X  Dilués dans la solution de blocage (lait ou BSA)

X X X X

Lavage = supprime l’excès d’Ac 1aires Membrane

X X X X

Membrane

Western-blot

Incubation avec Anticorps secondaires

 Anticorps secondaire = dirigé contre l’espèce à laquelle appartient l’anticorps primaire (ex: souris, chèvre, lapin)  Couplés à une enzyme (peroxydase ou phosphatase alcaline) Perox Perox Perox Perox

X X X X

Lavage = supprime l’excès d’Ac 2aires Perox Perox Perox Perox

X X X X

Membrane

Western-blot

Révélation par chemiluminescence

 Ajout du substrat de l’enzyme  Clivage avec relargage d’un produit émettant de la lumière  Impression d’un film photographique  Révélation photo Perox Perox Perox Perox

X X X X

Ex: Stabilisation du facteur de transcription HIF-1 α par l’hypoxie

Western-blot

Western blot: Résumé

 Extraction et préparation des échantillons - Protection vis à-vis des protéases - Dosage Dénaturation  Electrophorèse Dépôt et migration des échantillons sur gel (selon leur poids moléculaire) - Transfert sur membrane  Immunodétection Blocage des sites aspécifiques - Incubations avec Ac 1aire puis 2aire Révélation

Western-blot

Immunoprécipitation

 Isoler une protéine d’intérêt à partir d’un lysat cellulaire  Utiliser un Ac spécifique de la protéine d’intérêt  Précipiter le complexe Protéine-Ac avec une forme insoluble de protéines se liant à des anticorps (ex: Protein G)  Centrifuger la suspension: la protéine d’intérêt est séparée Western-blot  Interactions protéines-protéines, protéine-médicament  Concentration d’une protéines présente en faible quantité

Immunocytochimie

Immunocytochimie

 Méthode d’analyse des cellules

in situ

par une technique d’immunofluorescence  Révéler et cibler une molécule biologique à l’échelle cellulaire avec des anticorps spécifiques  Utilisation d’un fluorochrome couplé à: - anticorps primaire = immunofluorecence directe - anticorps secondaire = immunofluorecence indirecte Ex: Mise en évidence du cytosquelette  Anticorps 1aire anti-tubuline  Anticorps 2aire couplé à la fluorescéine

Immunocytochimie

Immunocytochimie: Méthode

Cellules en culture Fixation (PFA 4%) Lavages au PBS Anti-actine Perméabilisation au Triton X-100 (0,05%) Analyse au microscope Anticorps 2aire couplé au fluorochrome Lavages au PBS Blocage des sites aspécifiques (BSA 3%) Anticorps 1aire (une nuit – 4°C)

Immunocytochimie

Immunocytochimie: exemple

Facteur de transcription HIF-1 α (Hypoxia Inducible Factor) Présence O 2 - Absence O 2   cytoplasmique nucléaire  transcription de gènes nécessaires à la survie cellulaire Fibroblastes de membrane synoviale humains + mimétique (CoCl 2 150 µM) pendant 24 h Témoin CoCl 2

Immunocytochimie

Les fluorochromes Exemples

DAPI Excitation à 365 nm; émission à 420 nm - Contre-coloration de fond des noyaux - Fluorescence bleue FITC: Isothiocyanate de Fluorescéine Excitation à 490 nm ; émission à 520 nm - Fluorescence verte TRITC: Tetra methyl Rhodamine Iso Thio Cyanate Excitation à 541 nm ; émission à 572 nm - Fluorescence rouge

IMMUNIHISTOCHIMIE ET IMMUNOHYSTOFLUO

 Méthode d’analyse des cellules

in situ

dans les tissu  Révéler et cibler une molécule biologique à l’échelle cellulaire avec des anticorps spécifiques  Utilisation un anti corps secondaire couplé à une enzyme (HRP ou ALP)  Utilisation un anti corps secondaire couplé d’un fluorochrome - anticorps primaire = immunofluorecence directe - anticorps secondaire = immunofluorecence indirecte

IMMUNIHISTOCHIMIE ET IMMUNOHYSTOFLUO

Détection du collagène type deux Révéler par ALP coloration rouge Détection du GFAP Révéler par fluorescence

Les differents type de microscopie

.

ELISA

ELISA

Expression des gènes

Étude de l’expression  Extraction des ARNs  Reverse Transcriptase  PCR semi quantitative et quantitative Blocage de l’expression  siRNA

Extraction d’ARN Cellules en culture

Extraction d’ARN

- Enlever le milieu de culture - Ajouter le Trizol - Gratter avec une spatule Récupérer dans un tube Conservation à -80°C Dosage à 260 nm Resuspension dans l’eau UP Lavage à l’Ethanol 70°C Ajout Chloroforme Vortex Incubation sur glace Ajout Isopropanol = Précipitation ARN à -20°C Centrifugation Culot d’ARN Phase aqueuse = ARN totaux Protéines Centrifugation Phénol + Chloroforme = Débris cellulaires

Transcription inverse

Transcription inverse (1)

ARN  ADN complémentaire  Molécule moins fragile  Conservation à -20°C  Sélection des ARNm  Matrice pour la réaction d’amplification Enzyme  Transcriptase inverse isolée de rétrovirus à ARN

Transcription inverse

Transcription inverse (2)

Kits commerciaux avec: Enzyme + tampon d’activité dNTPs en quantité suffisante - DTT  élimination des structures 2aires des ARNs - Amorces polydT  sélection des ARNm ARNm AAAAA 10 min à 70°C DTT AAAAAAAA

TTTTTTTTT

1h – 37°C 15 min – 70°C

Amorce oligo dT TTTTTTTTT

ADNc

PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR)

 Méthode d’amplification génique

in vitro

 Permet de copier en grand nombre (facteur de multiplication de l'ordre du milliard), une séquence d'ADN ou d'ARN connue, à partir d'une faible quantité (pg) d'acide nucléique  Utilisation d’amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse (20 à 25 nucléotides)  obtention d’un amplicon de taille connue Basée sur:  L’utilisation d’enzymes ADN polymérase ADN dépendantes thermostables  Les propriétés d’hybridation et de déshybridation des brins complémentaires d’ADN en fonction de la température

PCR

PCR: étapes d’un cycle

PCR

PCR: en pratique

 Animation Flash  Au final, on obtient un très grand nombre de copies du gène d’intérêt, visualisables sur gel

PCR

PCR: dépôt sur gel

 Gel d’agarose = maillage  Plus solide et moins toxique que l’acrylamide  ADN chargé négativement, migre selon sa taille (ADN linéaire)  Plus % agarose est élevé, plus on sépare les petits fragments  Visualisation avec du Bromure d’Ethidium (agent intercalant) Ajouté lors de la préparation du gel - En solution dans laquelle le gel est plongé après migration M échantillons

PCR

PCR quantitative ou en temps réel

 A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total ou d’amplicon est mesurée grâce à un marqueur fluorescent.

 Suivi de la cinétique complète = quantification absolue de la quantité initiale d’ADN cible 2 techniques: - agents se liant à l’ADN (ex: SYBR Green) - sondes fluorescentes (ex: Taqman) 2 conditions: - Fluorescence augmentée lorsque lié à l’ADN double brin - Pas d’inhibition de la réaction de PCR

PCR

PCRq: SYBR Green

 Étape de dénaturation: le colorant libre émet peu de fluorescence  Étape d’hybridation et d’élongation:  fluorescence associée à la quantité de colorant se fixant à l’ADN double brin  Lorsque suivi en temps réel, l’augmentation du signal de fluorescence est observée pendant l’étape de polymérisation et l’émission fluorescente décroît complètement lorsque l’ADN est dénaturé à l’étape suivante  Étape de dénaturation: extinction de la fluorescence  Mesure à la fin de l’étape d’élongation

PCR

PCRq: SYBR Green

Avantages:  Utilisation simple  Pas de sonde  Nécessité d’amorces spécifiques  Pas affectée par la présence de mutations sur l’ADN cible Inconvénient  Se fixe à n’importe quelle molécule d’ADN double brin  Visualisation des produits aspécifiques

PCR

PCRq: Technologie Taqman



Hydrolyse de sonde

Basée sur l’activité 5’-exonucléasique de la Taq polymérase pour hydrolyser une sonde hybridée à sa séquence cible sur l’amplicon durant l’étape d’hybridation/extension de la PCR.

 Un fluorochrome émetteur (reporter) (ex. FAM : 6-carboxyfluorocein) est fixé à l’extrémité 5’ de la sonde d’hybridation et son émission est inhibée par un second fluorochrome suppresseur (quencher) présent à l’extrémité 3’ (ex. TAMRA : 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine).  Lorsque stimulé, le fluorochrome émetteur transfère son énergie au fluorochrome suppresseur voisin par le principe FRET (fluorescence resonance energy transfer) qui dissipe cette énergie sous forme de chaleur plutôt que d’émettre de la fluorescence.

PCR

PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde

 Hybridation de la sonde  Fixation de l’amorce et élongation  Hydrolyse de la sonde  Émission de fluorescence L’émission de fluorescence augmente à chaque cycle proportionnellement au taux d’hydrolyse de la sonde

PCR Précautions:

PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde

 Nécessité d’un A, un C ou un T à l’extrémité 5’ parce qu’un G supprime la fluorescence de l’émetteur même après clivage  Tm de 5 à 10 °C plus élevé que les amorces afin de s’assurer qu’elles s’hybrideront avant les amorces et qu’elles demeureront hybridées pendant l’étape combinée d’hybridation et de polymérisation Avantage:  Plus spécifique Inconvénient:  Pas idéale pour la détection des mutations

PCR

PCRq: Cycle seuil (Ct)

 Base de la quantification précise et reproductible de l’ADN par fluorescence  Valeurs de fluorescence enregistrées à chaque cycle représentent la quantité d’amplicons produits à un instant précis  Plus il y a de matrices à amplifier au départ de la réaction de PCR, moins élevé sera le nombre de cycles requis pour atteindre un point où le signal d’émission de fluorescence sera statistiquement et significativement plus élevé que le bruit de fond)  Ce point est défini comme étant le cycle seuil (Ct) et apparaîtra toujours au cours de la phase exponentielle d’amplification.

PCR

PCRq: Courbe de fusion

« Melting curve »

 Chaque produit d'ADN double brin synthétisé a une température de fusion (Tm) spécifique, définie comme étant la température à partir de laquelle 50% de l'ADN est sous forme double brin et 50% sous forme simple brin.

 Étape supplémentaire programmée en fin des cycles d’amplification  45 °C à 75°C par palier de 0.1°C avec acquisition de la fluorescence en continu

PCR

PCRq: Courbe de fusion

« Melting curve »

 Dérivée première de la fluorescence en fonction de la température  Vérification de la spécificité des sondes

PCR

PCRq vs PCR classique

 Quelques ng d’ADN suffisent  Rapidité du run (~ 1 h vs 2h30)  Sensibilité  Quantification précise (si droite d’étalonnage avec une quantité connue)  Logiciels d’analyse = exportation des résultats et gain de temps

Autre aplication de la qpcr

Etude interaction proteine proteine Co Immuno précipitation Fret colocalisation

Etude interaction proteine adn gemsa ship Trans activation

Régulation expérimental de l’expression des gène Transfection Si RNA

Les animaux transgenic Transgenique Ko Et conditionelle

Conclusions

 Importance des outils de la biologie moléculaire  Etude de l’expression génique - Transcriptionnel (ARNm) - Traductionnel (Protéines) ne correspondent pas toujours  Etudes de localisation - Localisation fonctionnelle - Physiologique vs pathologique  Limites: - Disposer d’un matériel en quantité suffisante Spécificité (anticorps, amorces, etc…)