Transcript File - Cours M1 UE7 Biologie moléculaire de la cellule

Cours M1 - 2012
Introduction aux
techniques de biologie
moléculaire
Partie 2
Western-blot
Extraction des protéines
Echantillon d’origine:
 Tissu (foie, cœur, etc…)
 Cellules (cultures primaires, lignées cellulaires)
Extraction des protéines:
 Tampon
- PBS/EDTA + Inhibiteurs de protéases
- Tris-HCl
 Séparation fraction/extraits totaux
- Centrifugation
- Ultracentrifugation
Débris
cellulaires
Surnageant
= Protéines
Western-blot
Dosage des protéines
- Méthode du Biuret:
- Méthode de Lowry:
Réduction du Cu2+ en Cu+
Réduction du Cu2+ en Cu+
Réaction avec Trp, Tyr, Cys
Réduction du réactif de Folin
Couleur bleue, pic abs 550 nm (phénolique: jaune en bleue), pic abs 750 nm
Peu sensible
2-100 µg, zone de linéarité étroite
- Méthode de Bradford:
Bleu de Coomassie (se lie à Arg, Tyr, Trp, His, Phe)
Rouge (abs 470 nm) et bleu lorsque lié aux protéines (abs 595 nm)
Très sensible (0,2 – 20 µg), très rapide, interférence avec certains détergents
- Méthode BCA
Acide bicinchonique
Formation complexe coloré avec Cu+
Couleur violette, pic abs à 562 nm
Très sensible, rapide, compatible avec les détergents
Western-blot
Dosage des protéines: exemple
Solution d’Albumine
bovine à 1 mg/mL
Dilution en séries
Echantillon à
doser
Distribution
Mesure au spectrophotomètre
DO
Droite étalonnage
DO échantillon
Conc échantillon
Concentration
Western-blot
Dépôt et migration des échantillons
Gel SDS-page
Sodium Dodecyl Sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis
Gel de concentration (pH 6,8)
5% acrylamide)
Gel de séparation (pH 8,8)
5-15% acrylamide
+ pourcentage est élevé
+ densité réseau est élevée
+ mailles sont serrées
Sens de
migration
Western-blot
Dépôt et migration des échantillons
Solution de dépôt:
- Tampon HCl pH 6,8  Idem gel de concentration
- Bleu de bromophénol  Suivi de la migration
- Glycérol  Densifier l’échantillon
Séparation selon le poids moléculaire des protéines
Western-blot
Coloration du gel
 Contrôle de l’homogénéité de la migration
 Vérification de la présence de protéines
 Bleu de Coomassie (coloration homogène)
 Nitrate d’Argent (plus sensible, parfois moins homogène)
Western-blot
Transfert sur membrane
- Pression, application d’un courant
- Fixation des protéines de façon non-spécifique:
- Interactions ioniques
- Interaction hydrophobes
- Membranes nitrocellulose / PVDF
Western-blot
Coloration de la membrane
 Contrôle de l’efficacité du transfert
 Contrôle de l’homogénéité des dépôts
 Coloration réversible
Immunocytochimie
Les fluorochromes
 Substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence
après excitation
 Sont caractérisés par:
- un spectre d’absorption
- un spectre d’émission
Ex: Fluorescéine
Absorption des radiations bleues Émission d’une fluorescence
(max 490 nm) verte (max 520 nm)
Immunocytochimie
Les fluorochromes
Diagramme de Jablonski
S1
État excité
Niveau
d’énergie des
électrons
d’une
molécule
fluorescente
Emission
Fluorescence
S0
État fondamental
Absorption
Laser
Gel retard
Étude des facteurs de transcription
Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
Facteur de
transcription
activé
Recrutement du
complexe d’activation de
la transcription
ADN
Séquence de
fixation
spécifique
TATA box
Gène
 Étude de la fixation d’un facteur de transcription sur sa séquence cible
Gel retard
Principe (1)
 Retard de migration dans un gel natif de polyacrylamide de duplexes
d'oligonucléotides de séquences courtes (15 à 30 nucléotides) en
présence de protéines (ou de complexes protéiques) ayant la propriété de
reconnaître spécifiquement la séquence d'intérêt.
 Marquage radioactif au P32 des sondes nucléotidiques.
 Spécificité de reconnaissance des sondes marquées testée par l'ajout en
excès du même duplexe non radioactif qui entrent en compétition avec la
forme radioactive.
 Présence de protéines spécifiques dans le complexe retardé peut être
mise en évidence par l'ajout d'anticorps spécifiques qui permettent un retard
plus important sur le gel appelé " supershift ".
Gel retard
Principe (2)
Sondes spécifiques
marquées au P32
*
*
*
*
Protéines nucléaires extraites
+
*
*
*
*
*
*
- Fixation de la protéine sur sa
séquence cible
- Élimination des autres
*
*
*
Dépôt sur un gel natif
*
*
Sonde + protéine + Ac
= « Super-Shift »
*
Sonde + protéine
*
*
Sonde libre
Gel retard
Résultats
Extraits nucléaires de cellules Hela
Inconvénients: - Extraction de protéines nucléaires
- Manipulation de la radioactivité
Immunocytochimie
Le microscope à fluorescence
Filtre correspondant au fluorochrome utilisé
 Filtre d’excitation (2): permet de sélectionner les
radiations absorbées par le fluorochrome (fluorescéine:
490 nm)
 Miroir dichroïque (3): ne réfléchit que les radiations
absorbables vers l’échantillon et ne laisse passer par
transmission que les radiations vertes
(fluorescéine: > 500 nm)
 Filtre d’émission (6): ne laisse passer par
transmission que les radiations vertes
(fluorescéine: > 500 nm)
1-lampe à arc
2-filtre d'excitation
3-miroir dichroïque
4-objectif
5-préparation
6-filtre d'émission
7-oculaire
Immunocytochimie
Le microscope à fluorescence
Ex: Fluorescéine
Le filtre d'excitation
sélectionne les
radiations spécifiques
du fluorochrome...
...qui sont réfléchies
par le miroir et
éclairent
l'échantillon...
...celui-ci émet les
radiations de fluorescence
qui seules atteignent
l'oculaire.
siRNA
small interfering RNA (siRNA)
 ARN simple ou double brin, qui interfère avec un ARNm spécifique
conduisant à sa dégradation et à la diminution de sa traduction en
protéine
 Mécanisme très spécifique
 Permet l’étude des gènes
siRNA
RNA interférence
ARN double brin
introduit dans la
cellule (siRNA)
DICER Ribonucléase qui clive l’ARN
double brin toutes les 21 à 25 pb
DICER
Clivage de l’ARNm
cible par RISC
Elimination d’un des brins
du siSNA, dit « passager »
Ciblage des ARNm de la
cellule possédant une
séquence complémentaire
Complexe RISC
(RNA-Induced Silencer
Complex)
siRNA
RNA interférence
- Nécessité d’une complémentarité parfaite entre le siRNA et sa cible
 Mécanisme très spécifique
- Possibilité de choisir un siRNA capable de cibler un ARNm porteur
d’une mutation ponctuelle sans affecter l’ARNm sauvage
- Introduction du siRNA 24h avant le début de la manip
- Vérification par western-blot de l’extinction de la protéine
Anand et al., 2007
Frede et al., 2005
Extraction d’ARN
Extraction d’ARN
 Molécules très fragiles
- Matériels stérile, RNAses et DNAses free
- Travail sur glace
- Port de gants
- Pointes avec filtre
 Extraction Phénol/Chloroforme
 Utilisation du Trizol® : - Phénol = isole les ADN et ARN
- Isothiocyanate de guanidium = dénaturation protéines
- Anti-RNases