Transcript Protéomique d`expression différentielles

La protéomique d’expression différentielle
L’analyse différentielle consiste à comparer au travers de la présence des
molécules biologiques, deux situations.
Ceci est réalisé quotidiennement dans les LAM : détection d’un syndrome
d’inflammation révélé par la présence de la protéine CRP. Si on cherche à
comprendre l’amplitude et l’évolution du syndrome, il est nécessaire de corréler la
concentration sérique de la CRP avec celles de l’orosomucoïde et de
l’haptoglobine.
Pour découvrir sans a priori de nouvelles molécules d’intérêt
Transcriptome : évènements post-traductionnels pas vus et les
aspects cinétiques au niveau des protéines pas considérés
Protéome :
la méthode la plus utilisée actuellement : la 2D-PAGE
Une nouvelle méthode : l’ICAT (Isotope Coded Affinity Tag)
Patrick O’FARRELL 1970
Actuellement responsable
d’un laboratoire à
l’Université de Californie
John YATES
Actuellement responsable
d’un laboratoire au Scripps
Research Institute La Jolla
en californie
La protéomique d’expression différentielle par gel 2D
Deux conditions (ex : cancer – pas cancer, traitée-non traitée)
Les protéines modifiées entre deux situations cellulaires distinctes
doivent être effectivement détectables sur gels 2D et à un taux
permettant leur identification
Les variations détectées devront être répétitives et statistiquement validées
Enrichissement en protéines d’intérêt avant la 2D
Sur un gel le rapport d’intensité entre le plus petit et le plus gros spot est de 104
Dans une cellule la dynamique d’expression est au moins de 105 voire de 106
Les protéines impliquées dans la transduction de signaux sont rarement
mises en évidence sur les gels 2D (100 à 1000 protéines par cellule). Or ces
protéines assurent des fonctions très importantes en terme de régulation. Il
faut donc utiliser des moyens qui permettent de faire des tris sélectifs de
molécule.
Tri par différences de solubilité
Pas la cellule entière mais seulement un des compartiments ou
organites : noyau, cytoplasme, mitochondrie
Extraction sans détergent va favoriser l’extraction des protéines
cytoplasmiques
L’utilisation de solutions ayant un pouvoir d’extraction croissant va
favoriser la solubilisation des protéines hydrophobes
Enrichissement en protéines d’intérêt avant la 2D
Pré-fractionnement des extraits par chromatographie et méthodes dérivées
Sans a priori
Fractionnement de l’extrait protéique selon un critère physico-chimique
(charge, hydrophophilie,…). Toutes les fractions sont ensuite analysées par
2D.
Avec a priori
Sélection d’une famille de protéines : phosphoprotéome, glycoprotéome
Anti-phosphotyrosine
Enrichissement en protéines d’intérêt avant la 2D
Pré-fractionnement des extraits par isoélectrofocalisation
Rotofor®
Deux approches d’analyse différentielle des gels 2D
Comparaison statistique entre plusieurs gels
DIGE : DIfferential Gel Electrophoresis
Acquisition des images
Gel 2D
Données numériques
x
Les pixels ont une valeur de densité
optique (DO) proportionnelle à
l’intensité du signal enregistré
y
Dans un gel le rapport de DO
entre le plus petit spot et le plus
gros est de 104
Méthode de détection
•Sensible
•Linéaire
Méthode de détection
Bleu de coomassie alcoolique ou colloïdal
Métaux lourd
Sonde fluorescente
µg
0,2 ng Gamme étroite
2 ng
Instrumentation de digitalisation
Tube photosensible + scanner (lampe fluorescente ou faisceau laser)
Trans-illuminateur à décharge gazeuse + caméra CCD refroidie
Écran phosphorescent
PhosphorImager
Typhoon
Les logiciels d’analyse d’image
Année 70 : Gellab, Tycho, Lips ou Elsie
Système d’exploitation non
programmable
Année 80 : Quest, Mélanie et Kepler
Année 90 : Mélanie II, PDQuest, Phoretix 2D
Aujourd’hui :
Progenesis développé par NonLinear Dynamics Newcastle
Mélanie 4 developpé par SIB à Genève
Unix
Windows 95 ou NT
Windows XP
Progenesis
≈ 80 000 €
Mélanie
Version gratuite sans la 3D
Analyse statistique
Une analyse différentielle fiable nécessite une comparaison entre des
séries d’au moins trois à quatre gels
Outils statistiques
•Analyse heuristique
•Analyse par correspondance
NT
Détermination de la dispersion
entre les gels des différentes
séries
NT
NT
NT
Les protéines cytoplasmique des cellules humaines du lymphome de Burkitt
antiIgM
951 spots
Lymphome malin non différencié, retrouvé en Afrique centrale mais également dans d'autres régions
du monde. La principale manisfestation est une grande lésion ostéolytique de la mâchoire inférieure
ou une masse abdominale.
Michel CARON Paris 2002
Analyse protéomique du carcinome hépatocellulaire
Jean Rosenbaum Bordeaux 2002
Nicotinamide N-methyltransferase
Ig Kappa Chain V
Tissu non tumoral
Nicotinamide N-methyltransferase
Ig Kappa Chain V
CHC
Reproductibilité des gels d’electrophorèse 2D: gels résultant de 4 expériences
indépendantes réalisées sur le même échantillon
Cas 1
Cas 2
Cas 3
Cas 4
Tissu non
tumoral
CHC
Diminution de la formininotransferase cyclodesaminase dans les CHC
Cas 1 2 3 4
Clusterisation hiérarchique
Cas 1 2 3 4
Protéines sur-exprimées dans le foie tumoral
Cas 1 2 3 4
Protéines sous-exprimées dans le foie tumoral
DIGE : DIfferential Gel Electrophoresis
N-hydroxy-succinimidyl ester :
réaction de
substitution nucléophile avec le groupe amine en e
des lysines pour former une amide
Differential 2D-Gel Electrophoresis (DIGE)
Esophageal Scans Cell Cancer-specific Protein Markers
Esophageal Scans Cell Cancer-specific Protein Markers
DIGE gel images of normal and cancer cells
Cy3 image of proteins from
normal cells
Cy5 image of proteins from
tumor cells
SYPRO Ruby-stained gel
image
Effects of Culture on Abundance of Myocyte Proteins
iTRAQ™ développé par Applied Biosystem
The iTRAQ™ reagents consist of a charged reporter group, a peptide reactive
group and a neutral balance group. The peptide reactive group reacts with primary
amines and labels all peptides. An increase in the overall protein coverage results
from all peptides being labeled.
114
+
31
145
115
+
30
145
116
+
29
145
117
+
28
145
As these tags are isobaric in MS, quantitation occurs in MS/MS using
reporter ions. Investigation of 75,000 accumulated MS/MS spectra identified
a quiet region between m/z of 113-119. Reporter ions reside in this quiet
region.
Depiction of a multiplexed reaction of 4 different samples. MS/MS spectra of
iTRAQ™ reagent labeled peptide shows good y- and b- ions for peptide
sequencing. Zoomed section shows the reporter ions used for quantitation.
Efficient multiplexing (n=4) allows multiple comparisons across samples that enable
the inclusion of duplicates and triplicates into experimental design.
MS/MS spectra of BSA peptide AEFVEVTK labeled with iTRAQ™ reagents
shows a significant enrichment of both the y- and b- ions (without peak
splitting), providing higher confidence in peptide identifications. Data collected
on Q TRAP® System.