Transcript RESUME

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Etude de la O-GlcNAcylation du complexe MiniChromosome Maintenance MCM2-7.
Impact sur la formation du complexe de pré-réplication et l'initiation de la phase S.
RESUME
La O-GlcNAcylation des protéines est une glycosylation dynamique sous le contrôle d’un couple unique
d’enzymes : la O-GlcNAc-Transférase (OGT) qui transfert un résidu unique de N-acétylglucosamine (GlcNAc) sur
les Ser/Thr des protéines intracellulaires à partir de son substrat-donneur l’UDP-GlcNAc, et la O-GlcNAcase
(OGA) qui hydrolyse ce résidu lié aux protéines. Parmi les protéines cytosoliques et nucléaires
différentiellement O-GlcNAcylées au cours de la progression des cellules MCF7 dans le cycle, nous avons
identifié les protéines Minichromosome Maintenance MCM2, MCM3, MCM6 et MCM7, suggérant pour la
première fois un rôle potentiel de l’OGT dans le contrôle de la réplication de l’ADN, via la glycosylation des
protéines du complexe MCM2-7. Le complexe hexamérique MCM2-7 est un acteur essentiel pour le contrôle
de l’initiation de la phase S car il fait partie du complexe multiprotéique de pré-réplication (preRC) mis en place
progressivement au niveau des origines de réplication dès la fin de la mitose. La formation et l’activation du
complexe MCM2-7 sont régulées par l’interaction des MCM avec différents partenaires tels que les licensing
factors Cdt1 et Cdc6, ainsi que par des phosphorylations induites par les CDK et Cdc7/Dbf4.
Le sujet de thèse proposé vise à comprendre le rôle fonctionnel de la O-GlcNAcylation sur le complexe
MCM2-7. Nos premiers résultats montrent que les MCM modifiées par la O-GlcNAc sont majoritairement
associées à la chromatine et que la perturbation du niveau de O-GlcNAcylation dans les cellules cancéreuses
affecte l’expression de certaines d’entre elles. Les objectifs de la thèse seront de déterminer si l’OGT interagit
avec les protéines MCM et si la perturbation du niveau de O-GlcNAcylation (siRNA, inhibiteurs) affecte
l’expression, la formation et l’activité du complexe MCM2-7. Une compétition éventuelle entre
phosphorylation et O-GlcNAcylation des protéines MCM sera évaluée en modulant la O-GlcNAcylation
(inhibiteurs de l’OGT ou l’OGA) ou en inhibant l’activité kinasique de CDK2. Enfin, la localisation des sites OGlcNAc des MCM par ETD-MS/MS nous permettra d’exprimer les mutants de glycosylation d’une protéine
MCM choisie, et d’en étudier l’impact sur sa phosphorylation et sa stabilité, ainsi que sur l’interaction avec ses
partenaires et l’activité du complexe MCM2-7. L’ensemble de ces résultats apportera de nouveaux éléments
de compréhension sur le rôle de l’OGT dans les mécanismes moléculaires impliqués dans l’initiation de la
synthèse d’ADN.
I- CONTEXTE SCIENTIFIQUE
1. La O-GlcNAcylation est une modification post-traductionnelle impliquée dans le contrôle du cycle
cellulaire
La O-GlcNAcylation des protéines est une glycosylation dynamique sous le contrôle d’un couple unique
d’enzymes : la O-GlcNAc-Transférase (OGT) qui transfert un résidu unique de N-acétylglucosamine (GlcNAc) sur
les Ser/Thr des protéines intracellulaires à partir de son substrat-donneur l’UDP-GlcNAc, et la O-GlcNAcase
(OGA) qui hydrolyse ce résidu lié aux protéines. Cette MPT se trouve au carrefour des voies de signalisation
mitogène et du métabolisme glucidique, participant à la régulation des protéines cibles en modulant leur
activité enzymatique, leur stabilité, leur localisation cellulaire ou encore les interactions protéine-protéine
(Hart et al., 2011).
Un nombre croissant de travaux soulève l’importance de la régulation du niveau de O-GlcNAcylation
pour le déroulement normal du cycle cellulaire. Dans le modèle d’ovocyte de Xénope, nous avons montré que
l’entrée en phase M est accélérée lorsque le niveau de O-GlcNAc est augmenté (Dehennaut et al., 2007;
Dehennaut et al., 2008). Dans des cellules somatiques, une perturbation de la dynamique O-GlcNAc induite par
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des inhibiteurs pharmacologiques, par l’extinction ou la surexpression de l’OGT ou l’OGA, ralentit la
prolifération cellulaire et retarde la progression des cellules en G2/M, associé à des défauts de cytokinèse
conduisant à l’apparition de cellules aneuploïdes (Slawson et al., 2005 ; Yang et al., 2012). Plus récemment,
nous avons caractérisé la balance O-GlcNAc lors de la reprise du cycle cellulaire et de la transition G1/S. Nous
avons montré que lors de la sortie de quiescence, la synthèse protéique de l’OGT est induite et requise pour
l’expression de la cycline D (Olivier-Van Stichelen et al., 2012) et que la progression des cellules en G1
s’accompagne d’une élévation du niveau de O-GlcNAcylation suivie d’une forte baisse des protéines O-GlcNAc
dès l’entrée en phase S (Drougat et al., 2012).
Une dérégulation de la dynamique de O-GlcNAcylation est retrouvée dans les cellules humaines cancéreuses.
En effet, une hyper-O-GlcNAcylation des protéines associée à une surexpression de l’OGT a été mise en
évidence dans les tumeurs de sein (Caldwell et al., 2010 ; Champattanachai et al., 2013), de la prostate (Lynch
et al., 2012), du côlon et du poumon (Mi et al., 2011) et de l’œsophage (Qiao et al., 2012). De ces travaux
récents émerge l’idée que l’altération du métabolisme énergétique dans les cellules tumorales conduirait à une
élévation de la O-GlcNAcylation, de par le lien direct entre le susbtrat-donneur de l’OGT l’UDP-GlcNAc et
l’entrée du glucose via la voie de biosynthèse des hexosamines (Kaelin et Thompson, 2010 ; Slawson et al.,
2010). L’hyper-O-GlcNAcylation favoriserait alors les propriétés malignes des cellules cancéreuses, en termes
de potentiel prolifératif, migratoire, invasif et anti-apoptotique (Ma et Vosseller, 2013).
D’un point de vue moléculaire, l’extinction de l’expression de l’OGT par ARN interférence impacte
l’expression de protéines essentielles à la régulation du cycle cellulaire : cela diminue l’expression de la cycline
D1 dans des cellules cancéreuses de prostate (Ma et al., 2013) et augmente l’expression de l’inhibiteur p27kip1
dans les cellules cancéreuses mammaires (Caldwell et al., 2011), provoquant ainsi une diminution de la
prolifération des cellules cancéreuses. Par ailleurs, Wells et collaborateurs ont mis en évidence une forme OGlcNAcylée de la protéine du rétinoblastome pRB, un des acteur majeur de la phase G1, pRb glycosylée et
hypophosphorylée étant capable d’interagir avec le facteur de transcription E2F (Wells et al., 2010).
Néanmoins, le rôle fonctionnel de cette glycosylation sur ce suppresseur de tumeur n’a pas encore été élucidé.
Enfin d’identifier d’autres cibles directes de l’OGT potentiellement impliquées dans les événements précoces
du cycle cellulaire, nous avons réalisé l’étude du O-GlcNAcome différentiel. Nous avons ainsi identifié une
soixantaine de protéines cytosoliques et nucléaires différentiellement O-GlcNAcylées au cours de la
progression des cellules MCF7 dans le cycle cellulaire (G0/G1/S) (Drougat et al., 2012). Parmi les protéines
nucléaires identifiées, nous avons montré une glycosylation dépendante du cycle cellulaire des protéines
Minichromosome Maintenance MCM2, MCM3, MCM6 et MCM7, suggérant pour la première fois un rôle
potentiel de l’OGT dans le contrôle de la réplication de l’ADN, via la glycosylation des protéines du complexe
MCM2-7.
2. Le complexe MCM2-7 : un acteur essentiel du complexe de pré-réplication
L’initiation de la réplication de l’ADN est régulée par la mise en place progressive sur les origines de
réplication d’un complexe multiprotéique de pré-réplication (preRC, pre-replicative complex) très conservé chez
les eucaryotes (Masai et al, 2010). Ce complexe est composé séquentiellement du complexe ORC (Origin
Recognition Complex), de Cdc6 (Cell division cycle 6 homolog), de Cdt1 (Chromatin licensing and DNA
replication factor 1), et enfin d’un double complexe hexamérique MCM2-7 lui-même composé des protéines
MCM2/3/4/5/6/7.
La régulation du complexe preRC est cruciale pour l’intégrité du génome car des défauts dans la réplication de
l’ADN peuvent conduire à une instabilité génétique susceptible d’introduire des mutations et de provoquer des
anomalies cellulaires impliquées dans la cancérisation (Gonzales et al., 2005 ; Blow and Gillespie, 2008). Ainsi,
in vivo, les protéines MCM sont surexprimées dans de nombreux cancers et leur surexpression est souvent
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corrélée au potentiel prolifératif de la tumeur (Perou et al., 1999 ; Giaginis et al., 2009 ; Giaginis et al., 2010 ;
Wojnar et al., 2011). De plus, une surexpression des protéines MCM au cours du processus de cancérisation a
été mise en évidence dans un modèle cellulaire de cancérogenèse (Pütz et al., 2010). Chez la souris, une
mutation hypomorphique de MCM4 entraîne une instabilité génomique sévère conduisant à un
adénocarcinome mammaire dans 80% des cas (Shima et al., 2007).
Deux types d’évènements cellulaires participent chronologiquement à la mise en place puis à
l’activation du complexe MCM2-7. Dès la fin de la mitose et pendant la phase G1, les licensing factors Cdc6 et
Cdt1 permettent le recrutement progressif des MCM à la chromatine. En amont, des régulateurs-clés de la
phase G1 tels que le complexe Cycline D-CDK4/6 et le facteur de transcription E2F coordonnent la transcription
de protéines essentielles à l’initiation de la réplication de l’ADN, dont Cdc6, Cdt1 et les protéines MCM. Dans
une deuxième étape, le preRC est activé grâce aux kinases CDK et Cdc7-Dbf4 qui en phosphorylant les MCM
induisent un changement de conformation du preRC, facilitant ainsi le recrutement de d’autres facteurs de
réplication essentiels à l’activation de l’activité hélicase du complexe, notamment les protéines Cdc45, GINS et
MCM10. Une fois l’entrée en phase S initiée par l’activation de l’ADN polymérase, plusieurs mécanismes
entrent en jeu pour éviter une re-réplication du génome et libérer le complexe MCM2-7 de la chromatine
(Masai et al, 2010).
Malgré les connaissances actuelles sur la régulation des protéines MCM, de nombreux points restent à
éclaircir sur la finesse de régulation du complexe pre-RC et de l’initiation de la réplication de l’ADN, notamment
sur le rôle exact des modifications post-traductionnelles sur les protéines du complexe de pré-réplication
(Alabert and Groth, 2012).
 Dans ce contexte scientifique, le projet de thèse porte sur l’étude du rôle fonctionnel de la OGlcNAcylation sur les protéines MCM.
II. Etats des travaux sur le rôle fonctionnel de la O-GlcNAcylation sur le complexe
MCM2-7
 En fonction du cycle cellulaire, les protéines MCM nucléaires sont fixées ou non à la chromatine. Par
fractionnement subcellulaire et enrichissement des protéines O-GlcNAc sur la lectine WGA-agarose ou après
click-chemistry, nous avons déterminé dans les cellules MCF7 et MDA-MB-231 synchronisées que la forme
glycosylée de chacune des 6 protéines MCM se trouve très majoritairement, voire exclusivement, dans la
fraction des protéines liées à la chromatine et que les formes O-GlcNAcylées des protéines MCM augmentent
lorsque les cellules progressent vers la phase S.
 Afin d’étudier l’impact de la perturbation de la dynamique O-GlcNAc sur l’expression des MCM, nous
utilisons deux approches: d’une part, l’extinction de l’expression de l’OGT ou l’OGA par ARN interférence
(siRNA) sur cellules asynchrones ; d’autre part, inhibition de l’activité de l’OGT ou de l’OGA respectivement par
l’acétyl-5S-GlcNAc et le Thiamet G, dans des cellules synchronisées dans le cycle cellulaire. L’analyse en
cytométrie en flux montre que l’inhibition de l’OGT par le 5S-GlcNAc retarde significativement l’entrée et la
progression des cellules dans la phase S, alors que l’inhibition de l’OGA n’a pas d’effet comme observé
précédemment (Drougat et al, 2012). Par contre, sur cellules asynchrones, nous n’avons pas observé d’effet
des siRNA OGT/OGA sur la répartition dans le cycle cellulaire après 72 heures de transfection alors que la
prolifération cellulaire diminue significativement dans les cellules siOGT.
L’analyse par western-blot de l’effet des siRNA et des inhibiteurs sur l’expression des protéines MCM est en
cours (sur les 2 lignées cellulaires, à partir de lysat total ou après fractionnement subcellulaire). D’après les
premiers résultats, la perturbation du niveau cellulaire de O-GlcNAcylation affecte l’expression de certaines
MCM, suggérant que l’OGT et l’OGA pourraient réguler spécifiquement certaines protéines du complexe
MCM2-7. Ces données sont encourageantes car dans le complexe MCM2-7, on distingue un trimère très stable
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composé des MCM4/6/7 qui porterait l’activité hélicase, auquel viennent s’ajouter MCM2 et le dimère
MCM3/MCM5 (Masai et al, 2010).
III- PROJET DE THESE
1. La perturbation de la dynamique O-GlcNAc affecte-t-elle l’expression, la formation ou la fixation du
complexe MCM2-7 à la chromatine (1ere année)
 La progression du cycle cellulaire sera suivie par cytométrie en flux (marquage iodure de propidium) et
le taux de réplication de l’ADN sera mesuré plus précisément par incorporation de 3H-thymidine sur des temps
courts (20 min à 1h) dans les différentes conditions expérimentales (inhibiteurs, siRNA).
 Afin de compléter les premiers résultats obtenus, l’impact des siRNA OGT/OGA sur l’expression des
MCM sera évalué par western-blot, sur cellules synchronisées afin de mieux observer la reprise du cycle
cellulaire et la transition G1/S (extraits totaux et fractionnement subcellulaire).
 Pour les protéines MCM dont l’expression est sensible à la dynamique de O-GlcNAcylation, nous
déterminerons si c’est une régulation transcriptionnelle (par qRT-PCR) et/ou traductionnelle (+/- traitement par
l’inhibiteur de synthèse protéique cycloheximide).
 L’impact des siRNA OGT/OGA et des inhibiteurs sur la formation du complexe MCM2-7 sera évalué par
des expériences de co-IP des protéines MCM endogènes à différents moments du cycle cellulaire (G0/début
G1/fin G1/début S). En fonction des résultats de co-IP, l’approche Duolink (ou Proximity ligation assay, PLA)
sera utilisée pour visualiser in cellulo l’interaction directe entre deux protéines en microscopie confocale
(plateforme BICeL-IFR147, Université de Lille 1).
2. L’OGT s’associe t-elle au complexe MCM2-7 ? (1ere année)
 L’interaction possible (directe ou indirecte) entre l’OGT et les protéines MCM sera évaluée grâce à des
expériences de co-immunoprécipitation (IP) sur les protéines endogènes à partir de lysats de cellules MCF7 et
MDA-MB-231 synchronisées ou non dans le cycle (IP OGT WB MCM et IP MCMWB OGT). Des vecteurs
d’expression des protéines d’intérêt (OGT et MCM), taggée ou non seront également utilisés (prioritairement
dans les cellules HEK qui se transfectent très bien et dans lesquelles les protéines MCM liées à la chromatine
sont également glycosylées)
 L’approche de co-IP sera complétée par la technique PLA.
3. Y a-t-il compétition entre phosphorylation et O-GlcNAcylation sur les protéines MCM (2eme année)
 Certains sites de phosphorylation des MCM sont bien connus pour réguler l’activité du complexe
MCM2-7, comme la Ser139 de MCM2, cible de Cdc7/Dbf4 et la Ser112 de MCM3 modifiée par CDK1 et pour
lesquels il existe des anticorps phospho-résidu spécifiques. En modulant la O-GlcNAcylation dans les cellules
synchronisées à l’aide des inhibiteurs de l’OGT ou l’OGA, nous déterminerons s’il existe une compétition entre
ces deux MPT. Cela sera étudié par western-blot, après SDS-PAGE (pour anticorps anti-phospho-MCM
disponibles) ou électrophorèse 2D (shift acide du point isoélectrique de la protéine par les phosphorylations).
 Sachant que la phosphorylation des MCM par les CDK est connue pour réguler leur fixation sur la
chromatine (Masai et al, 2010), l’effet de l’inhibition pharmacologique de CDK2 par le SNS-032 sur la OGlcNAcylation des protéines MCM sera déterminé par click-chemistry (transfert enzymatique de GalNAz et
click-chemistry avec une sonde biotine-alkyne, Invitrogen).
4. Cartographie des sites O-GlcNAc sur les protéines MCM par spectrométrie de masse (1ere-2eme années)
 Pour aborder plus précisément la fonctionnalité de la modification O-GlcNAc sur le complexe MCM2-7,
la localisation des sites O-GlcNAc par spectrométrie de masse est nécessaire. Les conditions d’IP des différentes
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MCM ont été optimisées à partir des cellules MCF7, MDA-MB-231 et HEKT. L’analyse par ETD-MS/MS des sites
O-GlcNAc après IP des MCM2/3/4 est en cours (pour l’analyse MS, collaborations avec le Dr Armelle Buzy,
Sanofi, Toulouse et le Dr Luc Camoin de l’institut Paoli-Calmettes, INSERM U1068 - UMR CNRS 7258, Marseille).
 Si la quantité immunoprécipitée de MCM endogènes restait cependant trop faible pour cartographier
les sites de glycosylation, les IP seront refaites à partir de cellules transfectées transitoirement par des
plasmides exprimant ces protéines sous une forme taggée ou non.
5. Analyse fonctionnelle de mutant de glycosylation d’une protéine MCM (fin 2eme année-3eme année)
La cartographie des sites O-GlcNAc sur les MCM est un pré-requis pour la partie du projet concernant la
caractérisation plus fine du rôle de la O-GlcNAcylation sur le complexe MCM2-7. En fonction des résultats de
spectrométrie de masse (localisation de 1 ou plusieurs sites, sur une ou plusieurs MCM) et de ceux obtenus au
§1 et §2, nous choisirons une protéine MCM pour laquelle seront construits des mutants du/des sites de
glycosylation (QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit, Life technologies). Après transfection transitoire des
cellules (MCF7 ou HEKT), nous débuterons l’étude de l’effet de cette/ces mutations sur la phosphorylation de la
MCM, sur l’interaction avec ses partenaires (co-IP et PLA), sur la stabilité (traitement +/- inhibiteur du
protéasome MG132).
CONCLUSION
Les résultats attendus de ce projet visent à décrypter le rôle de la O-GlcNAcylation sur la régulation du
complexe de pré-réplication, qui est un acteur essentiel pour le contrôle de l’initiation de la duplication du
génome. Ces résultats sont un pré-requis de connaissances pour déterminer, à plus long terme, dans quelle
mesure une dérégulation pathologique de la O-GlcNAcylation des protéines du complexe pre-RC pourrait
contribuer à la prolifération anarchique des cellules cancéreuses.
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O-GlcNAcylation of MiniChromosome Maintenance complex MCM2-7.
Impact on the formation of the pre-replicative complex and S phase initiation.
I- Scientific background
1. O-GlcNAcylation is a post-translational modification involved in cell cycle regulation
O-GlcNAcylation of proteins is an abundant and reversible modification governed by O-GlcNAc transferase
(OGT) that transfers the N-acetylglucosamine (GlcNAc) residue onto Ser/Thr of proteins from the nucleotidesugar donor uridine diphosphate N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc), and O-GlcNAcase (OGA) that removes the
sugar from proteins. This glycosylation, which is often in competition with phosphorylation, can modulate the
stability, the subcellular localization or the interaction of the protein targets with their partners (Slawson et al,
2010).
Increasing numbers of studies have shown performed on human somatic cell lines and in the wellestablished mitosis model of Xenopus laevis oocytes have highlighted that the dynamics of O-GlcNAc is
regulated in a cell cycle-dependent manner. Indeed, we demonstrated that G2/M transition was accompanied
with an increase in the level of O-GlcNAcylated proteins and required OGT activity in Xenopus oocytes
(Dehennaut et al., 2007; Dehennaut et al., 2008). In somatic cells, several studies showed that the OGlcNAcylated protein level and OGT expression were higher in M phase than in G1 phase. In addition,
disruption of O-GlcNAc level by OGT/OGA overexpression or inhibition affected cell cycle progression and
induced severe defects in mitosis, indicating that O-GlcNAc cycling is crucial for the correct sequence of events
leading to cellular division (Slawson et al., 2005 ; Yang et al., 2012). More recently, we characterized the
dynamics of O-GlcNAcylation during cell cycle entry and through G1/S transition in synchronized human cells.
We showed that serum-stimulated cell cycle entry promotes OGT synthesis required for cyclin D expression
(Olivier-Van Stichelen et al., 2012). We also observed a global increase in O-GlcNAcylation level through G1
phase, followed by a decrease in O-GlcNAcylation at S phase entry concomitantly to an increase in the activity
of OGA (Drougat et al, 2012).
Moreover, a deregulation of O-GlcNAc cycling is observed in human cancer cells. A hyper-O-GlcNAcylation
associated with an overexpression of OGT is frequently observed in breast tumors (Caldwell et al., 2010 ;
Champattanachai et al., 2013), as well in prostate, colorectal and lung cancers (Lynch et al., 2012; Mi et al.,
2011). These reports highlight the strong hypothesis that alteration of energetic metabolism in tumoral cells
would lead to an increase in O-GlcNAcylation as the nucleotide-sugar UDP-GlcNAc, donor of the GlcNAc group,
is dependent of glucose uptake through the hexosamine biosynthesis pathway (HBP). Increase in OGlcNAcylation would thus favor malignant properties of cancerous cells, including proliferation, migration,
invasion and survival (Ma et Vosseller, 2013).
From a molecular point of view, RNA interference of OGT affects the expression of key cell cycle-proteins:
G1 phase specific-cyclin D expression is decreased in prostatic cancer cells (Ma et al, 2013) and p27kip1
inhibitor is overexpressed in breast cancer cells (Caldwell et al., 2011), inducing a decrease in proliferation of
cancer cells. Moreover, the tumor suppressor pRb has been shown to be O-GlcNAcylated but the role of this
glycosylation on pRb remains to be elucidated (Wells et al, 2010). In order to identify new protein targets of
OGT during cell cycle progression, we identified nucleocytoplasmic proteins for which differences in OGlcNAcylation status were observed between G1 and S phases. We showed that changes in O-GlcNAc dynamics
differentially affected cytosolic and nuclear proteins, including several components of the minichromosome
maintenance MCM2-7 complex that takes part in the initiation of DNA replication (Drougat et al, 2012). These
results suggest for the first time that OGT could play a role in regulating DNA synthesis through the
glycosylation of MCM2-7 complex.
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2. The MCM2-7 complex is part of the pre-replicative complex
The initiation of eukaryotic DNA replication is a precisely regulated event that requires the ordered
assembly of multiple protein complexes at replication origins. The processes of replication initiation are divided
into two steps (Masai et al, 2010). In the first step, the ORC, the licensing factors Cdc6 and Cdt1, and MCM2-7
proteins (which is an heterohexameric complex composed of MCM2/3/4/5/6/7) are sequentially assembled on
the chromosome at the late M to early G1 phase, generating a pre-replicative complex (pre-RC). In the second
step, pre-RCs are activated to generate active replication forks. At the G1-S transition, the activities of two
kinases, the Cdc7-Dbf4 and the CDK, facilitate the loading of other essential replication proteins onto the preRC to activate the replicative DNA helicase and initiate chain elongation by DNA polymerases. Loading of the
MCM complex onto DNA is referred to as DNA replication licensing. Upon entry into the S phase, multiple
mechanisms ensure that no new pre-RC is formed, so that rereplication of any portion of the genome does not
take place.
Ample evidence indicates that defects in the process of DNA replication could result in genomic instability,
which could lead to mutations and abnormal tissue growth as observed in cancer (Gonzales et al., 2005 ; Blow
and Gillespie, 2008). In vivo, MCM proteins are overexpressed in cancers and their overexpression is often
correlated with the proliferative rate of the tumor (Perou et al., 1999 ; Giaginis et al., 2009 ; Giaginis et al.,
2010 ; Wojnar et al., 2011). Mutation in MCM4 is known to cause severe genomic instability, and 80% of
female die of mammary adenocarcinoma (Shima et al., 2007). Overexpression of MCM proteins has also been
observed in a cellular model of malignant transformation (Pütz et al, 2010). Thus, perturbation of pre-RC
formation can lead to DNA damage or a chromatin aberration, which could eventually lead to carcinogenesis.
Despite the increasing knowledge on the regulation of MCM2-7 and pre-replicative complexes, numerous
points remain to be elucidated, including the precise role of post-translational modifications on proteins
involved in pre-RC.
 Given this scientific background, our project is to decipher the biological function of O-GlcNAcylation
on the hexameric complex MCM2-7 which is essential for initiation of DNA synthesis.
II- Biological function of O-GlcNAcylation on the MCM2-7 complex : Preliminary
results
 As a function of cell cycle progression, MCM proteins can be either in a soluble nuclear form or loaded
onto chromatin. We used cell cycle- synchronized MCF7 and MDA-MB-231 cells. Using subcellular fractionation
and enrichment of O-GlcNAc proteins either on WGA-agarose lectin beads or click-chemistry approach, our
results show that the glycosylated MCM proteins are mainly if not exclusively present in the chromatin-bound
protein fraction. Moreover, glycosylated forms of MCM proteins increase as cells progress through S phase.
 To evaluate the impact of disrupting O-GlcNAc cycling on MCM proteins expression, we use two cellular
approaches: RNA interference of OGT or OGA (siRNA) in asynchronous cells, and inhibition of OGT/OGA activity
by acetyl-5S-GlcNAc and Thiamet G, respectively, in synchronized cells.
FACS analysis shows that 5S-GlcNAc treatment induces a delay in S phase entry and progression, whereas
Thiamet G has no effect. In contrast, no significant effect on cell cycle progression has been observed after RNA
interference of OGT or OGA in asynchronous cells despite the decrease in cell proliferation rate in siRNA OGTtransfected cells.
Western-blot analysis of siRNA and inhibitors treatments is ongoing. Preliminary results indicate that disrupting
O-GlcNAc cycling affects the expression of some of the 6 MCM proteins. This suggests that OGT could regulate
specifically some of the MCM proteins inside the MCM2-7 complex, knowing that the stable trimer MCM4/6/7
is believed to have the helicase activity whereas MCM2 and MCM3/5 dimer are more probably regulatory
subunits (Masai et al, 2010).
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III- Thesis Project
1. Does perturbation of O-GlcNAc cycling affect the expression, formation, and activity of MCM2-7
complex? (1st year)
 In the different cell culture conditions (siRNA, inhibitors), cell cycle progression will be assessed by flow
cytometry analysis after iodide propidium labeling. DNA synthesis rate will be measured by 3H-Thymidine
incorporation during short periods (20 min to 1 hour)
 To complete our preliminary results, impact of siRNA OGT/OGA on MCM proteins expression will be
analysed by Western-blotting on synchronized cells (MCF7, MDA-MB-231), to focus on cell cycle entry (G0/G1
transition) and G1/S transition (total extracts and subcellular fractionation).
 For O-GlcNAc level-sensitive MCM, we will determine whether it’s a transcriptional regulation (qRTPCR) and/or a translational regulation (+/- translation inhibitor cycloheximide).
 The impact of RNA interference (OGT/OGA) and inhibitors on the association of the 6 MCM will be
evaluated by co-IP experiments on endogenous MCM proteins (G0/early G1/ late G1/early S). According to
these results, further study will be performed using the in situ Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize the
interaction between two proteins by confocal microscopy (plateforme BICeL-IFR147, Université de Lille 1).
2. Does OGT interacts with MCM proteins? (1st year)
 Potential interaction (in/direct) between OGT and MCM proteins will be analyzed through co-IP
experiments of endogenous proteins in cellular lysates from asynchronous or synchronized cells (IP OGT WB
MCM et IP MCMWB OGT). Plasmids encoding tagged or not protein of interest (OGT, MCM) will be also used
in HEK T cells to perform co-IP experiments.
 PLA approach will also be used as a complementary approach.
3. Is there any competition between O-GlcNAcylation and phosphorylation onto MCM proteins? (2nd
year)
 Some of the regulatory phosphorylation sites of MCM are known, including Ser139 of MCM2,
phosphorylated by Cdc7/Dbf4 kinase and Ser112 of MCM3 modified by CDK1. For these 2 sites, phosphospecific antibodies are commercially available.
By modulating O-GlcNAc cellular levels (5S-GlcNAc, Thiamet G) in synchronized cells, we will determine
whether the phosphorylation of MCM proteins is affected or not. This will be evaluated by western-blot after
SDS-PAGE (using phospho-specific MCM antibodies) or two-dimensional electrophoresis (acidic shift of
isoelectric point (pI) induced by phosphorylation).
 CDK activities are known to regulate the loading of MCM2-7 complex onto chromatin during G1 phase
(Masai et al, 2010). To further evaluate if a possible cross-talk between phosphorylation and O-GlcNAcylation
occurs on MCM proteins, conversely, the effect of CDK2 inhibition by SNS-032 on the O-GlcNAcylation of MCM
proteins will be analyzed by western-blot after click-chemistry (enzymatic transfer of GAlNAz then clickchemistry using a biotin-alkyne probe).
4. Mapping of O-GlcNAc sites of MCM proteins by mass spectrometry (MS) (1st-2nd years)
 To finely study the biological function of O-GlcNAc modification on MCM2-7 complex, it is necessary to
localize the glycosylated sites. We have already optimized the preparative IP for the MCM proteins in MCF7,
MDA-MB-231 and HEK T cells, in order to be able to visualize the Coomassie blue stained-band corresponding
to MCM. The ETD-MS/MS analysis is ongoing (collaborations with Dr Armelle Buzy, Sanofi, Toulouse and Dr Luc
Camoin, Institut Paoli-Calmettes, INSERM U1068 - UMR CNRS 7258, Marseille).
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 If immunoprecipitated endogenous MCM protein quantities are still too low to perform ETD-MS/MS
analysis, IP experiments will be performed after transitory overexpression of MCM proteins.
5. Functional analysis of glycosylation mutant of one MCM protein (end of 2nd year-3rd year)
Results obtained in previous paragraph are a prerequisite for this last part of the project. Depending of the
success of the MS/MS results (one or several sites, on one or several MCM proteins) and the results obtained in
the other parts of the work, we will choose the "best MCM candidate" to mutate the O-GlcNAc site(s) in an
encoding plasmid (QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit, Life technologies). Following transient
transfection of wild-type/mutant plasmids in MCF7 or HEK T cells, we will analyze the effect of the mutation(s)
on its expression, stability (+/- MG132 proteasome inhibitor) and interaction with partners (co-IP and PLA).
Conclusion
The results generated by this thesis will bring new insights in the role of OGT on the regulation of MCM2-7
complex which is an essential player in the control of initiation of DNA replication. They are a prerequisite to
further determine whether abnormal glycosylation of MCM proteins could contribute to a deregulated
proliferation of cancer cells.