Transcript TECHNIQUES Principes et applications

TECHNIQUES
Principes et applications
Culture de Tetrahymena
Données de base
• Température optimale: 28 °C
• Température minimale: environ 12-14 °C
• Température maximale: environ 31-32 °C
(choc thermique réversible)
• Temps de génération: 2h30-4h15
(normalement 4h)
Culture de Tetrahymena
Milieux de culture
• Culture axénique: sans autres microorganismes
• Milieu semi-défini
•
•
•
•
•
•
Source acides aminés: hydrolysat de protéine
Protéose, peptone, tryptone, lait
Source de vitamines: extrait de levure
Glucose
Sels: peu concentrés, maintien du pH
Na ou K, H2PO32-
Culture de Tetrahymena
Culture stock
• Température basse: 14°C
• Milieu pauvre
• Pas de source de vitamines ou glucose
• Peptone peu concentrée
=> Doit utiliser beaucoup d’énergie/temps pour
synthétiser vitamines et autres
• Croissance lente
• Repiquage moins fréquent
Culture de Tetrahymena
Culture de conditionnement
• Température presque optimale: 25°C
• Milieu riche
• source de vitamines ou glucose
• hydrolysats plus concentrées et variés
• Réadaptation progressive à des conditions
de croissance rapide
Culture de Tetrahymena
Culture de croissance
• Température optimale: 28°C
• Milieu riche
• source de vitamines ou glucose
• hydrolysats plus concentrées et variés
• Agitation: meilleure oxygénation
• Conditions de croissance rapide
• Obtention de grandes quantités de cellules
Culture de Tetrahymena
Culture massive
• Température optimale: 28°C
• Milieu très riche
• source de vitamines et glucose
• lait comme source d'acides aminés
• Agitation: meilleure oxygénation
• Conditions de croissance rapide
• Obtention de très grandes quantités de
cellules
Culture de Tetrahymena
Culture en milieu défini
• Milieu défini: [ ] exactes de toutes les
composantes individuelles sont connues
• Température optimale: 28°C
• Milieu
•
•
•
•
Acides aminés
Vitamines
Glucose
Autres éléments (ac. gras, minéraux….)
• => Connaissance et contrôle des conditions
Culture de Tetrahymena
Milieu minimal
• Tris 10 mM + pH 7.6 + Glucose
• Milieu simple pour incorporation acides
aminés marqués
• Pas de croissance
• Court terme
• "choc" => induisant une réponse ????
Tetrahymena
Concentration des cellules
• Dispositif de concentration
• Certaines manipulations requièrent des
concentrations de cellules non obtenues par
des cultures de croissance
Si on a besoin de concentrer les cellules
Tetrahymena
Concentration des cellules
Lang et Gauthier (1993)
Tetrahymena
Enumération à l'hémacymètre
• Détermination du nombre de cellules
• Hémacymètre
• Normalement destiné à
l'énumération des cellules du sang
2 cotés et 5 zones par coté
10 zones = 1 µL
Lamelle spéciale (coûteuse)
Cellules immobilisées (formaldéhyde)
Cellules cotés: supérieurs et gauches
http://www.bdbiosciences.com/discovery_labware/technical_resources/labtool
s/hemarefpf.html
Tetrahymena
Traitements
• Exposition à choc thermique ou toxique
• Cellules concentrées/diluées pour obtenir
conc. finale voulue
• Tubes contenant le milieu de culture (selon
volume final voulu)
+ toxique concentré --> conc. finale voulue
au temps = 0
+ cellules concentrées --> conc. finale voulue
+ N.p.o.: contrôle: volume identique dans chaque tube
+ 1 tube sans produit toxique: solvant du toxique
Traitements
• Incuber à T° voulue
• Prélever aliquotes aux temps voulus -->
µtubes (1.5 ou 2 mL)
• Centrifuger > 10 kRPM x 10 min -->
sédiment = cell.
• Extraire les cell. en resuspendant dans soln
voulue
§ SDS --> électro.
Electrophorèse (EGPA)
• Séparation des protéines par EGPA-SDS
• Protéines dénaturées: SDS et ßME + chauffage
• Charge uniforme + géométrie similaire
séparation selon masse
Système triphasique
• Tampon d'électrode: glycine
• Gel de tassement: Cl- pH 6.8 (conc. PA faible)
• Gel de séparation: Cl- pH8.8 (conc. PA forte)
==> échantillons volumineux peuvent être compactés pour
donner une résolution supérieure
Electrophorese
Principe de la séparation
Gel de tassement
Gel de séparation
Direction
de
migration
Indicateur
de migration
(Bleu de
briomophénol)
Electrophorèse
Analyse des protéines synthétisées
• Electrophorèse
• Tassement
• Séparation
• Fixation et Coloration
• Ac. Acétique 10%
• Bleu de Comassie (simple et sensible)
• Argent (complexe mais très sensible)
• Buvardage ou Séchage + conservation
Buvardage
principes
• Transférer à la surface d'une matrice
solide
• Différentes matrices: nitrocellulose…
PVDF, nylon.
• Capacité d'adsorption
• Buvardage: transfert électrophorétique
• Adsorption: forces hydrophobes, ioniques
• Méthanol. porosité de la matrice, durée et
puissance du transfert
Transfert western
mécanisme
Gel d'acrylamide
Matrice solide
(nitrocellulose)
Direction de
migration
Immunodétection
• Identification et détection d'une protéine
spécifique
• Anticorps spécifique à la protéine d'intérêt
• Adsorption antigène d'intérêt sur la matrice
• Buvardage électrophorétique
• Application directe ("dot blot")
Immunodétection
précautions
• Blocage des sites inoccupés
• Protéines: lait en poudre, albumine, collagene
(gélatine) => Ne contient pas antigène, anticorps,
enzyme indicateur
• Prévention des liaisons non spécifiques
• détergent doux: Tween (empêche adsorption Ag-Ab et
Ab-marice non spécifique)
Immunodétection
• Adsorption de l'anticorps sur l'antigène
(primaire)
• Adsorption de l'anticorps secondaire
conjugué avec enzyme sur l'antigène
primaire (autres marqueurs fluorochromes)
• Détection de l'enzyme:
Chromogénique
Chemiluminescent
Radioactif, fluorescent, etc.
Immunodétection: enzymes
• Phosphatase alcaline
• Sensible
• Bon contraste en photo
• Stable
• Peroxydase de raifort (HRP)
• Assez sensible
• Durée limitée incubation (H2O2)
• Coloration +/- stable (H2O2)
• Contraste moyen
Electro ou Immunodétection
Comparer des patrons de migration
• Déposer même quantité de protéines ou
protéines provenant d'une même quantité de
cellules = difficile
• Base de comparaison: étalon interne
• Protéine qui reste en quantité stable dans une
cellule
• Étalons courants: actine, GAP
Immunodétection
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Marquage métabolique des protéines
• Souvent on doit être capable de distinguer
les protéines dont la synthèse est
induite/ralentie par le traitement
• => Marquage métabolique:
• Exposition des cellules a des ac. Aminés
marqués
• Extraction et séparation des protéines
• Autoradio- ou fluorographie