Transcript Exploration des protéines plasmatiques Dysprotéinémies Protéines

Exploration des protéines plasmatiques
Dysprotéinémies
Protéines de l'inflammation
INTRODUCTION
• Le plasma humain renferme plus de 125
protéines différentes pour la plupart synthétisée
au niveau hépatique
• Leurs propriétés sont très variables ,mais il faudra
différencier les protéines toujours présentes dans
le plasma, et celles, d'origine cellulaire, n'y
apparaissant que transitoirement.
• Les protéines représentent la plus grande partie
des matières solides du Plasma :65 à 75 g/l .
• Seule la sérum-albumine est une
holoprotéine.
• Toutes les autres étant des hétéroprotéines
pouvant contenir des lipides (lipoprotéines),
des métaux (métalloprotéines) et surtout
des glucides.
• la plupart des protéines plasmatiques sont
en effet des glycoprotéines.
• En dehors du fibrinogène, protéine fibreuse,
ce sont toutes des protéines globulaires.
RÔLES DES PROTÉINES PLASMATIQUES
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Maintien de la pression oncotique.
Fonction de transport.
Inhibiteurs des protéases.
Cofacteur d’enzyme.
Facteur de la coagulation.
Rôle immunitaire.
Maintien de la pression oncotique
• L es protéines étant des macromolécules
pouvant s’hydrater fortement et exercer une
pression osmotique capable de retenir l’eau
dans le secteur vasculaire.
• Ce rôle est assuré par l’ensemble des
protéines mais principalement par la sérumalbumine.
Albumine
• Dans le plasma, l'albumine est la protéine dont la
concentration est la plus élevée: 33-55g/l
• Elle est synthétisée par l'hépatocyte
• Holoprotéine masse relative est de 66 400 Da.
• .Sa demi-vie est de 20 jours environ .
• migration électrophorétique rapide.
Les grandes fonctions de l’albumine.
• Maintien de la pression oncotique
intravasculaire (pour environ 80 %). Une
albuminémie faible favorise la formation d‘
œdème.
• Elle transporte de nombreuses substances :
bilirubine, acides gras, cations (Ca++, Ni++, Cu++),
hormones (rôle de réservoir de T4, stéroïdes...),
médicaments( ex: diphénylhydantoïne...) et
autres.
Role de transport
• En dehors de la sérum-albumine
• On cite : la transferrine, la céruloplasmine
,transcortine(cortisol) ,transthyrétine(thyroxines)
ainsi que les lipoprotéines(transport + ou spécifique).
Transferrine
• La transferrine est une glycoprotéine
monomérique de masse moléculaire d'environ 80
000 Da.
• La transferrine est la protéine de transport du fer.
• La synthèse de la transferrine a lieu dans les
hépatocytes et est inversement proportionnelle à
la quantité de fer présente dans la cellule.
• Les taux usuels sont de 1,5 à 3 g/l
Rôle inhibiteur de protéase
• Protéines possédant des propriétés inhibitrices visà-vis des protéases diverses circulant dans le
plasma.
• Ex: α1antitrypsine /trypsine,antiplasmine/ plasmine
Anti-protéase ou α1-antitrypsine
• En réalité elle est capable d'inhiber bien
d'autres sérine-protéases
• le taux normal est de 2 à 4 g/l.
a2-macroglobuline
• c'est une glycoprotéine volumineuse P.M= 750 000 Da.
• Elle se combine aux diverses enzymes protéolytiques
circulantes
• Elle limite les effets néfastes de la réaction inflammatoire en
inhibant les enzymes lysosomiales déversées.
• .Les valeurs de référence sont: 2 à 3,5 g/l.
Rôles de cofacteur d’enzymes
Α1-acide glycoprotéine: orosomucoide:
• Glycoprotéine la plus riche en glucides de
faible PM=41KDa.
• Synthèse et catabolisme hépatique.
• Taux : 0.4 a 1.4 g/L.
• Coenzyme des LPL hydrolysant les TG.
• Inhibiteur de l’agrégation des plaquettes.
• Très bon Marqueur de l’inflammation
Roles dans la coagulation
• Fibrinogène
• C'est une glycoprotéine, PM= 330 000 Da
• Il est synthétisé essentiellement dans le foie
• Les valeurs de référence chez l'adulte sont 2,5
à 3,5 g/l.
Rôles immunitaires
les immunoglobulines :
sont le support de l'immunité humorale,
sous forme d'anticorps.
 sont fabriquées par les plasmocytes
Sont formées de 4 chaînes
polypeptidiques: 2 chaînes lourdes et 2
chaînes légères
L’Ig (4chaines glycosylée) P.M 150 000 Da.
Isotype
d’Ig
IgG
IgA
IgM
IgD
IgE
Taux en
g/l
8 à 12
2à4
0,6 ai,2
0,1 à 0,3
0,1 à 0,5
Structures particulières
L’ Ig M présentent une structure pentamérique
Poids moléculaire atteint ainsi 800000 à 1 000000 Da.
EXPLORATION BIOCHIMIQUE
L'exploration des protéines plasmatiques est réalisée par:
• la Détermination de l’hématocrite pour déceler une
éventuelle hémodilution ou une hémoconcentration.
• le dosage globale puis individuel de telle ou telle protéine.
• le regroupement de quelques dosages, sous le
terme de profil protéique.
• l'électrophorèse qui peut être faite sur des supports
différents .
• L’ immunoélectrophorése dans le cadre d’une gammapathie
Dosage des protéines totales.
Réaction du biuret ‘’Méthode colorimétrique’’
•
• Le biuret résulte de la condensation de deux
molécules d’uréeH2N-CO-NH-CO-NH2, qui en
présence de Cu en milieu alcalin, donne un
complexe bleu violet
• de même les protéines avec le sulfate de Cu vont
réagir par leur liaison peptidique.
• L’intensité de la coloration lu à 546nm est
proportionnelle à la concentration en protéines
dans le milieu.
Electrophorèse des protéines
plasmatiques.
• L'électrophorèse consiste à faire migrer et à
fractionner grâce à un champ électrique, au
sein d'un milieu variable et dans un tampon
de pH déterminé, les protéines séparées par
leur charge électrique.
• La migration se fait par une phase liquide
imprégnant une phase solide(gel)
Séparation sous forme de bandes révélées par
différents colorants.
La technique
• consiste à déposer quelques microlitres de sérum sur le support,
• à choisir un tampon, qui est généralement à pH 8,6 auquel les
•
•
•
•
protéines s'ionisent comme des anions, migrant donc vers
l'anode.
laisser migrer durant un temps fonction du support : 15 à 25
minutes pour l'acétate, 30 à 60 minutes pour le gel de
polyacrylamide.
Fixation et coloration par la suite.
Cependant le colorant varie avec la nature des composants à
révéler.
Pour le protéinogramme standard les colorants les plus utilisés
sont l'amidoschwarz, le rouge Ponceau ou le bleu de
Coomassie.
• Après transparisation du support, la lecture
photodensitométrique de la coloration de chaque
bande donne le tracé classique où apparaissent
les
• 5 pics : Albumine, α1 α2, β et γ-globulines.
• L'intégration de la surface de chaque pic conduit
enfin à un pourcentage de chaque fraction,
traduit aussi en gramme/litre si le taux des
protéines totales a été donné à l'appareil.
Remarque :
-Le fibrinogène migre en β(une bande proche du point de dépot), il peut
apparaître sur l’électrophorèse si un anticoagulant est utilisé ou si le tube
sec a mal coagulé
- En cas d’hémolyse, on peut observer un pic d’hémoglobine migrant en
β ou un pic d’hémoglobine liée à l’haptoglobine migrant en α2.
Electrophorèse de zone et ses
variantes :
 Electrophorèse sur Acétate de cellulose ou gel
d’agarose (séparation en fonction de la charge).
 Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
(séparation en fonction de la charge et la masse
molaire).
 Electrophorèse sur gel de polyacrylamide + SDS
(séparation en fonction de la masse molaire).
Immunoélectrophorèse
Cette technique est basée sur une double
diffusion en gel , permet l’identification des
constituants d’un mélange grâce à 2 propriétés
indépendantes:
Mobilité électrophorétique
Spécificité antigénique.
•Dans un premier temps, les molécules
antigéniques sont séparées grâce à leur
différence de mobilité dans un champ
électrique.
•Dans un deuxième temps, lorsque la
séparation est jugée suffisante, un
antisérum est placé dans une rigole
parallèle au sens de migration des Ag.
•Ag et Ac diffusent librement dans le
gel et donnent des arcs de récipitation
-
+
Ag
Ag
Ab
Ag
Ab
Profil protéique
 C'est la représentation graphique des dosages de plusieurs
protéines.
• exprimés en g/l ou mieux
• Exprimés en pourcentage de la normale .
 Deux types de profils peuvent être envisagés :
Un profil élargi, à 8 ou 10 protéines, dit d'orientation
met en évidence un maximum d'information biologique utile au
diagnostic ou au dépistage de complications.
Un profil spécifique réduit à quelques protéines
Permet de mettre en évidence des syndromes particuliers lorsque
l'examen clinique est peu évocateur (fièvre prolongée inexpliquée,
vitesse de sédimentation accélérée inexpliquée, altération de l'état
général sans cause évidente, algies diffuses) .
N.B : le profil protéique est toujours accompagné d'une
électrophorèse
Profil protéique
immunofixation
• C’est de l’immunoéléctrophorése, permet la détermination
de la nature du ou des composants monoclonaux dans une
GM et le typage de la chaine légère associée à
l’immunoglobuline éventuellement mise en évidence.
• Consiste en une électrophorèse des protéines en gel
d'agarose , suivie par une immunoprécipitation in situ des
immunoglobulines avec des antisérums spécifiques de
chaque isotope incubés à la surface du gel.
• sur un même gel six pistes du même échantillon subissent
l'électrophorèse puis cinq pistes sont recouvertes chacune
d'un immusérum monospécifique (anti-IgG, anti-IgA, antiIgM, anti-K, anti-λ), la dernière piste étant mise en contact
avec un réactif fixateur des protéines pour servir de
référence.
immunofixation
Immunofixation
Dysprotéinémie
a) Affections révélées par une perturbation de la
Concentration des proteins totales.
b) Affections révélées par perturbation du profil
éléctrophorétique.
c) Affections révélées par les variations individuelles des
différentes protéines plasmatiques.
Valeur normale et variations
physiologiques
• Valeur normale chez l'adulte : 70g/l (60-80 g/l)
• Variations avec l'âge: dans le sens de l'hypoprotidémie
- prématuré: 40g/l
- nouveau-né: 60g/l, avec chute à 45-50g/l au bout
de 4 jours
- nourrisson (2 ans): 60g/l
- après 70 ans: 65g/l par diminution de l'albumine
et/ou des Ig
- grossesse: 60g/l par hémodilution et diminution
de l'albumine et/ou des Ig
Affections révélées par perturbation du profil
électrophorétique/ protéique.
-Syndromes inflammatoire aigue ou chronique
-Syndrome néphrotique.
-Cirrhoses.
-Gammapathies polyclonales et monoclonales
-Insuffisance hépatique
-Hémolyse.
-Carences et surcharges en fer.
-Les dénutritions.
-Syndrome de fuite digestive….
Syndrome inflammatoire
Inflammation aigue: augmentation des α1(α1 antitrypsine,
orosomucoide ) et α2(haptoglobine)
Inflammation chronique: augmentation des α2 et γ globulines et
diminution de l’albumine qui masque partiellement l’
hyperprotidémie réactionnelle(taux des protéines totales normal)
Syndrome néphrotique
• diminution de l'albumine et de l’ensemble des globulines
sauf α2 macroglobuline et les β lipoprotéines responsable
d’un pic en α2.
• L’hypoprotidemie avec l’hypoalbuminémie provoque
l’abaissement de la pression oncotique et apparition
d’oedémes.
Cirrhose décompensée
Dans les cirrhose hépatiques décompensée on note
•Une diminution de l’albumine, des α et des β globulines
•Apparition d’un bloc β-γ caractéristique (augmentation des IgA’’β’’ et des IgG, IgM ‘’ γ’’).
Les gammapathies
Les hyperglobulinemies monoclonales se caractérisent par un pic etroit et aigu
au niveau de la zone γ
les hyperglobulinemies polyclonales se caractérisent par un dome plus ou
moins élevé au niveau de de la zone γ .
Hémolyse
Carence en fer.