Transcript 2 – techniques de microscopie

Année Universitaire 2010-2011
UE5
Cours du Dr R. GARNOTEL
La culture comme moyen d’étude du métabolisme :
Expression de macromolécules
(protéines, enzymes, acides nucléiques)
1 – INTRODUCTION
2 – TECHNIQUES DE MICROSCOPIE
2.1. La technique photonique
2.2. La microscopie électronique
3 – TRIEUR DE CELLULES ACTIVE PAR FLUORESCENCE
4 – FRACTIONNER LES CELLULES
4.1. Séparation des organites et des macromolécules
par ultracentrifugation
4.2. Séparation des protéines par chromatographie
5 – ETUDE DES PROTEINES
5.1. Technique d’électrophorèse SDS-PAGE
5.2 Technique d’électrophorèse bidimensionnelle
sur gel de polyacrylamide
5.3. Immuno-transfert ou Western-Blot
5.4. Clivage spécifique des protéines
5.5. Analyse de la composition en acides aminés des
peptides et des protéines
6 – ETUDE DES ENZYMES
6.1. Technique de zymographie
6.2. Etude des activités enzymatiques
7 – ETUDE DES ACIDES NUCLEIQUES
7.1. Etude de l’ADN
7.2. Etude de l’ARN
CONCLUSION
1 – INTRODUCTION
Techniques d’examen de la cellule dans son ensemble
Techniques d’analyse des macromolécules constitutives
de la cellule :
- protéines
- enzymes
- acides nucléiques :
ADN
ARN
2 – TECHNIQUES DE MICROSCOPIE
Une cellule animale type mesure de 10 à 20 µm de diamètre
 utilisation du microscope
Les cellules animales sont incolores et translucides
 techniques de coloration
2.1. La technique photonique
Permet de distinguer des détails éloignés de 0,2 µm
Les cellules sont fixées pour l’observation microscopique
La fixation rend les cellules perméables aux colorants et
provoque la réticulation des macromolécules, de sorte
qu’elles sont stabilisées et figées en position
(formaldéhyde, glutaraldéhyde forment des liaisons
covalentes entre les acides aminés libres des protéines)
Coloration des cellules :
- Hématoxyline (colorant ayant une affinité pour les
molécules chargées négativement)  mise en évidence
de l’ADN, l’ARN et les protéines acides dans les cellules
- Vert malachite, noir soudan …
Marquage des cellules : technique d’immunofluorescence
- Anticorps spécifique
- Double marquage
Les cellules vivantes peuvent être observées avec précision
au microscope à contraste de phase  visualisation du
noyau
2.2. La microscopie électronique
Résolution environ 1000 X celle de la microscopie photonique
2 nm
- Microscopie électronique à transmission
Préparation particulière car les échantillons sont exposés à
un vide très poussé dans le microscope électronique
 Observation non possible dans un état vivant et hydraté
Fixation des cellules par du glutaraldéhyde et du tétroxyde
d’osmium (qui se fixe sur les doubles couches lipidiques et
les protéines)
Les cellules sont incluses dans une résine et le bloc est
coupé au microtome (épaisseur de 50 à 100 nm) et les coupes
fines débarrassées de l’eau sont placées sur une fine grille
métallique circulaire pour être observées
 Observation de l’ultrastructure de la cellule en deux
dimensions
- Microscopie électronique à balayage
Permet d’obtenir des images tridimensionnelles de surface
L’échantillon étudié est fixé, déshydraté et recouvert d’une
fine couche de métal lourd. Il est ensuite balayé par un
faisceau très étroit d’électrons  aspect tridimensionnel
- Microscopie électronique par cryofracture et cryodécapage
Permet d’obtenir des images de l’intérieur des cellules
Congélation des cellules dans l’azote liquide (-196°C) en
présence d’un cryoprotecteur (antigel) qui empêche la
déformation due à la formation de cristaux de glace : le
bloc congelé est ensuite fracturé avec la lame d’un couteau
Le plan de fracture passe par la moitié hydrophobe des
doubles couches lipidiques,mettant à nu l’intérieur des
membranes cellulaires. Après ombrage au platine des surfaces
de fractures obtenues, la substance organique est dissoute,
puis les répliques sont prélevées et observées au
microscope électronique
3 – TRIEUR DE CELLULES ACTIVE PAR FLUORESCENCE
Permet d’isoler des cellules d’un type uniforme à partir d’un
mélange de types cellulaires
La technique du FACS (Fluorescence-activated Cell Sorter)
ou trieur de cellules activé par fluorescence implique le
marquage de cellules avec des anticorps couplés à un
colorant fluorescent, puis la séparation des cellules marquées
des non marquées dans un trieur de cellules
On évalue la fluorescence de cellules individuelles, qui
circulent sur une seule file dans un léger courant, en leur
faisant traverser un faisceau laser
Une canule vibratrice provoque, un peu plus loin en aval, la
formation de minuscules gouttelettes dont la plupart ne
contiennent qu’une cellule
Les gouttelettes contenant une cellule unique reçoivent
automatiquement une charge positive ou négative au moment
de leur formation, selon qu’elles contiennent ou non une
cellule fluorescente
Elles sont ensuite déviées par un fort courant électrique
dans le récipient approprié
Sélection :
1 cellule/1000
5000 cellules par seconde
4 – FRACTIONNER LES CELLULES
Il faut faire éclater les cellules :
- choc osmotique/hypothermique
- vibrations ultrasoniques
4.1. Séparation des organites et des macromolécules
par ultracentrifugation
Fractionnement cellulaire par centrifugation
Des homogénats cellulaires seront fractionnés en leurs
composants par centrifugations répétées à des vitesses
progressivement augmentées
Plus le composant subcellulaire est petit, plus la force
centrifuge nécessaire pour le sédimenter est élevée
Les valeurs typiques pour les différentes étapes de
centrifugation sont :
- vitesse basse : 1000 g pendant 10 minutes
- vitesse moyenne : 20 000 g pendant 20 minutes
- vitesse élevée : 80 000 g pendant 1 heure
- vitesse très élevée : 150 000 g pendant 3 heures
4.2. Séparation des protéines par chromatographie
Principe de la chromatographie sur colonne
L’échantillon est déposé au sommet d’une colonne cylindrique
de verre ou de plastique contenant une matrice solide
perméable, comme la cellulose, imprégnée dans un solvant
Une grande quantité de solvant est ensuite pompée
lentement à travers la colonne et est collectée dans des
tubes séparés au fur et à mesure de sa sortie à l’extrémité
inférieure de la colonne
Les divers composants de l’échantillon se déplacent à des
vitesses différentes à travers la colonne et sont ainsi
fractionnés dans des tubes différents
Suivant le choix de la matrice, les protéines peuvent être
séparées selon :
- leur charge (chromatographie par échange d’ions)
- leur taille (chromatographie par filtration sur gel)
- leur capacité à se fixer à des groupements
chimiques particuliers (chromatographie d’affinité)
5 – ETUDE DES PROTEINES
5.1. Technique d’électrophorèse SDS-PAGE
SDS-polyacrylamide-gel electrophoresis permet de déterminer
la taille et la composition en sous-unités d’une protéine
Gel de polyacrylamide fortement réticulé comme une matrice
inerte, à travers laquelle les protéines migrent
Plus la concentration en polyacrylamide est élevée, plus la
migration est ralentie pour les protéines de masse moléculaire
élevée
Le SDS, sodium dodécyl sulfate, est un détergent puissant,
chargé négativement, qui si lie aux régions hydrophobes de la
molécule protéique  masse moléculaire apparente
Le mercapto-éthanol, puissant agent réducteur, est ajouté
pour rompre tous les ponts S-S des protéines  détermination
des différentes sous-unités
5 – ETUDE DES PROTEINES
5.2 Technique d’électrophorèse bidimensionnelle
sur gel de polyacrylamide
Carte protéique bidimensionnelle  protéomique
Première étape : fractionnement des protéines par focalisation
isoélectrique, reposant sur le fait que la charge nette d’une
protéine varie avec le pH de la solution environnante
Pour chaque protéine, il existe un pH caractéristique, son
point isoélectrique, auquel la protéine possède une charge
nette nulle et ne migrera donc pas dans un champ électrique
Deuxième étape : électrophorèse SDS-PAGE, mais dans une
direction perpendiculaire à celle utilisée lors de la première
étape
Séparation  2000 chaînes polypeptidiques
5 – ETUDE DES PROTEINES
5.3. Immuno-transfert ou Western-Blot
Après électrophorèse mono ou bi-dimensionnelle, les protéines
sont transférées sur une membrane de nitrocellulose et
incubées avec un anticorps qui reconnaît, par exemple, celles
des protéines qui se phosphorylent sur des résidus thréonine
Les protéines qui sont reconnues par cet anticorps sont
révélées par un deuxième anticorps couplé à une enzyme,
puis révélation par substrat spécifique
Permet :
identification de protéines
identification de la phosphorylation des protéines
5 – ETUDE DES PROTEINES
5.4. Clivage spécifique des protéines
On dispose d’enzymes protéolytiques et de réactifs chimiques
qui coupent les protéines entre les résidus d’acides aminés
spécifiques
La trypsine est une enzyme qui coupe du côté carboxyle des
résidus de lysine ou d’arginine, alors que le bromure de
cyanogène est une substance chimique qui scinde les liaisons
peptidiques au voisinage des résidus méthionine
 Carte peptidique (« empreintes digitales » des protéines)
5 – ETUDE DES PROTEINES
5.5. Analyse de la composition en acides aminés des
peptides et des protéines
Liaison covalente entre la fonction aminée libre à l’extrémité
amino-terminale du peptide et une substance chimique
Cette substance chimique est ensuite activée par exposition
à un acide faible, de sorte qu’elle rompt spécifiquement la
liaison peptidique reliant l’acide aminé amino-terminal à la
chaîne peptidique
L’acide aminé libéré est ensuite identifié par chromatographie
Le peptide restant qui est plus court d’un acide aminé, est
ensuite sousmis à la même séquence de réactions, et ainsi de
suite jusqu’à ce que tous les acides aminés du peptide aient
été déterminés
 Séquençage d’acides aminés
6 – ETUDE DES ENZYMES
Les enzymes sont des protéines + activités enzymatiques
6.1. Technique de zymographie
- Gel de polyacrylamide en présence de 1% de gélatine
Electrophorèse des échantillons
2 X 30 minutes de Triton X100
Incubation 18 heures à 37°C dans du tampon contenant du
calcium
Coloration au Bleu Coomassie  plages blanches sur fond
bleu
Activités MMP-2/MMP-9
- Gel de polyacrylamide en présence de 1% de gélatine +
plasminogène
Plasminogène substrat pour uPA/tPA (plasminogene activateur)
6 – ETUDE DES ENZYMES
6.2. Etude des activités enzymatiques
Sur substrats spécifiques
Activités « in vitro »
7 – ETUDE DES ACIDES NUCLEIQUES
7.1. Etude de l’ADN
- Extraction d’ADN
Par technique de précipitation
Facile
- Amplification par PCR
Dénaturation
Hybridation des amorces
Synthèse d’ADN
- Technique de Southern Blot
7.2. Etude de l’ARN
- Extraction d’ARN
Technique délicate
- Amplification par RT-PCR
- Technique de Northern Blot
CONCLUSION
Techniques de microscopie
Fractionnement des protéines cellulaires
Etude des protéines et des enzymes
Etude des acides nucléiques
 identification et fonctions biologiques