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Analyse bio-instrumentale
A. Garnier
GCH-2103
A-2010
Mise en contexte

Problème réel: Quantifier la production en
adénovirus recombinant, produit par culture de HEK293S
–
–
–
–
Dynamique de la production
Méthodes standards longues, fastidieuses et peu précises.
Méthode indirecte, 1ère génération: suivre la protéine
d’intérêt (ici la PTP1C)
Méthode de 2ème génération: suivre l’expression d’un gène
rapporteur (ici la « green fluorescent protein », GFP) suite à
une infection secondaire, puis mesure au (fluorescence
assisted cell sorter » (FACS: directe ou indirecte?
Titration virale: Méthode de plage de lyse
FACS
Fluorescence
Généralisation

L’utilisation de gènes rapporteurs (reporter
genes) est très fréquente:
–

GFP, lac Z (le gène de la b-galactosidase, gène
de la luciférase)
Distinction importante entre méthode directe
et indirecte
–
Appliquer au cas de la mesure de la
concentration en micro-organismes
Méthodes directes pour la biomasse


Masse sèche (filtration)
Dénombrement:
–
–
–


Hemacymètre
Coulter
FACS
Avantages et inconvénients
Autres méthodes directes: utilisation de
colorants, CFU, dilutions limites…
Quelle est la précision des méthodes
basées sur le dénombrement

Rappel de la loi de Poisson:
–
–
–

x: nb d’évènements quelconques observés dans un
espace dimensionnel quelconque
n: espérance de x
espace dimensionnel peut être le temps, une longueur,
une surface, un volume, etc
Alors:
exp(n)  n
Pr(x, n) 
x!
x
Exemple classique: le standard
téléphonique

Un standard reçoit en moyenne 60 appels/h.
quelle est la probabilité qu’il reçoive 0, 1, 2,
3, etc appels durant la prochaine minute?






n = 1 appel/minute
x = 0, 1, 2, 3, etc
P(0,1) = exp(-1)*10 / 0! = 0,368
P(1,1) = exp(-1)*11 / 1! = 0,368
P(2,1) = exp(-1)*12 / 2! = 0,184
P(3,1) = exp(-1)*13 / 3! = 0,06 …..
Pr(x,1) vs x, pour n=1
0,4
0,35
0,3
P(x,1)
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
1
2
x (appels/min)
3
4
Pr(x,100) vs x
0,045
0,04
0,035
+/- 10%
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
x (-)
120
118
116
114
112
110
108
106
104
102
100
98
96
94
92
90
88
86
84
82
0
80
P(x,100)
0,03
Écart-type de la loi de Poisson




É.-t. (s)= n1/2
Estimation de l’é.-t. (s) = x1/2
Estimation de l’é.-t. relatif: s/x = x-1/2
Indication pour le dénombrement:
–
–
Limite inférieure: 100-200 évènements
Limite supérieure: « comptabilité »!
Autre application de la loi de Poisson:
dilutions limites
Ex: concentration d’un échantillon en micro-organismes =107 cellules/mL
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1 mL
d’échantillon
?
Milieux
initialement
stériles
9 ml
9 ml
9 ml
9 ml
9 ml
9 ml
9 ml
9 ml
7 éprouvettes contenant chacune 9 mL de milieu de culture stérile, inoculées, laissées à incuber
On peut calculer la probabilité que
P(x>0,n)
exp(n)  n x
Pr(x, n) 
x!
Pr(x  0, n)  1  Pr(x  0, n)  1  exp(n)
1,2
1
Pr(x>0,n)
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,5
1
1,5
2
n (-)
2,5
3
3,5
4
Dilutions limites répétées (ex préc.)
1 mL
d’échantillon
1 mL
d’échantillon
1 mL
d’échantillon
1 mL
d’échantillon
1 mL
d’échantillon
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10 1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10 1/10
1/10
1/10
P(x>0,n)=3/5
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10 1/10
1/10
1/10
n≈1
X = 107 !!!
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10 1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10 1/10
1/10
1/10
Méthodes indirectes de détermination de
la concentration en micro-organismes

Densité optique:
–
–
Turbidité: 545 nm
L’absorption lumineuse
peut également servir à
déterminer la
concentration en:
–
Protéines: 214nm
(lien peptidique),
280nm (aromatiques:
Tyr, Trp, Phe)
– ADN: 260 nm

Fluorescence…
Autres mesures du déroulement d’un
procédé de bioproduction





Nutriments: sucres, ac. aminés, vitamines, O2
Constituants cellulaires: ADN, protéines, ARN
(gene chip)
Sous-produits métaboliques: acides
organiques, alcools, ammoniaque, CO2
Produit d’intérêt
Autres: pH, T, vitesse d’agitation, viscosité,
mousse, marqueurs cellulaires, etc
Composition cellulaire
Variation de la composition cellulaire
Méthodes


Sondes: pH, OD, pCO2, T
Tests enzymatiques, exemples:
–
Glucose par hexokinase(hk) (mesure de la
fluorescence du NADH exc. 320-370, ém 420-460) :
Glucose + ATP
hk
G6P + ADP
G6P + NAD glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH) 6-PG +NADH
– G6PDH par G6P
G6P + NADP
G6PDH
6-PG + NADPH
Méthodes (suite)

Immuno-affinité:
Anticorps-antigène
Enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA)
La Réaction en chaîne par polymérase (PCR)
Animation tirée du site du Réseau Lyonnais d'Ingénierie Éducative (RELIE), École
Normale Supérieure de Lyon (cliquez sur le lien).
PCR en temps réel (real time)
Expression génétique

Biopuces
(cliquez sur une des images pour l’animation)
Séparation + détection

Électrophorèse (SDS-PAGE)
Western: EP +
anticorps spécifiques
à protéines
Southern: EP + ADN
marqué
Northern: EP + ARN
marqué
Électrophorèse SDS-PAGE
Tiré de Segura, Garnier et al (2007).
Figure 2. Fractionation of purified
retroviral vector preparations by 1D
Gel
Electrophoresis
Purified virus preparations with (a) and
without (b) subtilisin treatment were
fractionated on a 4-12% Tris-Glycine
polyacrylamide gel (Invitrogen) run
under reducing conditions and visualized
by silver staining. Protein bands from gel
b were excised and subjected to in-gel
tryptic digestion prior to MS/MS
analysis. Bands containing statistically
significant peptide identifications (A-L)
are indicated on gel b. Figure 2c shows
the protein profiles of samples a (green)
and b (blue) superimposed. The
theoretical migration positions of all
MoMLV viral-encoded proteins are
indicated in figure c.
Gel d’électrophorèse 2-D
2-DE des protéines soluble de levures
(Échantillon de sérum sanguin, Gygi et al., 2000)
Séparation + détection = chromatographie
Ex: High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
•Échange d’ions
•Tamis moléculaire
•Interaction hydrophobe
•Phase inverse
•Électrophorèse
•Automatique
•Réfrigéré
Échantilloneur
Réservoir de
Phase mobile
Pompe
Colonne
Échantillon
•En fonction
de la colonne
•Gradient
Détecteur
Collecteur de fraction
•UV/visible
•Fluorescence
•Infra-rouge
•Indice de réfraction
•Conductivité
•Spectrométrie de masse
Exemple de HPLC (Agilent 1100)
Hydrolysat trypsique de la BSA
Chromatographie
Chromatographie (suite)
Chromatographie (suite)

Temps de rétention: identification; surface sous le pic: quantification
tM: temps d’élution de la phase mobile
tR: temps de rétention
tR’: temps de rétention réduit = tR-tM
k: facteur de fixation = tR’/tM
s: écart-type d’un pic gaussien
d: largeur du pic à mi-hauteur = 2,354 s
w: largeur du pic à la base = 4 s
s/tR: écart-type relatif
N: efficacité de la colonne = (tR/s)2 = 5,545 (tR/d)2 = 16 (tR/w)2
N: nb de plateau théorique
H: hauteur de plateau théorique = L/N, où L: longueur de la colonne

Exemple: 2 colonnes de 25 cm, 1 et 2











tR1 = 416,4
- tR2 = 481,2
d1= 10,2s
- d2= 13,2s
Calculez N1, N2, h1, h2 identifiez la colonne la plus efficace
–

Chromatographie (suite)
Pour 2 pics:
–
–
–
a: facteur de sélectivité = tRB’/tRA’ = kB/kA, où B est le pic le plus à droite
Pour phase stationnaire, phase mobile et T données, a=constante
Résolution (RS)= Dt/w
Exemple, 3 pics A, B et C:
tM =83,4 s
tR(A)= 195 s
tR(B)= 415,4s
tR(C)= 481,2 s
Calculez aB/A et aC/B
Chromatographie (suite)
Calcul de Résolution (RS):
RS 
N  a  1  k B 



4  a  1  k B 

2 a
N  16RS 

a

1


16 RS 2 H
t R ( B) 
u
2
 1  kB 


 kB 
 a   1  kB 

 
2 
 a  1   kB 
2
3
où u = vitesse de la phase mobile
2
Spectroscopie de masse – arc
magnétique
Spectrométrie de Masse Quadrupole




m/z 10-4000
Précision :~m/z 0.1-0.2
Vitesse de balayage: 5000 m/z
par sec
Le temps de vie d’un ion de sa
formation a sa détection ~40100 μs.
www.bris.ac.uk
Spectrométrie de Masse - Temps
d’Envol (TOF)

L’incorporation d’un
réflectron dans le tube du
TOF ou une extraction
ionique délayée (Cornish et Cotter, 1994;
Cotter et al., 2004)

TOF est communément
employé avec MALDI, il peut
aussi être utilisé avec un
ESI (Boyle et Whitehouse, 1992)
www.chemistry.adelaide.edu.au
Spectroscopie de masse 3 (GCMS)
Spectroscopie de masse 1
Spectroscopie de masse 4 (LCMS)
Tout est dans l'interface LC-MS

L'electro-atomisation (electro-spray
ionisation, ESI)
Exemple d'analyse MS

Albumine
Protéine majeure du sérum sanguin (20-30 g/L), souvent utilisé en milieu de
culture de cellules de mammifères
Exemple d'analyse MS

Albumine
>P02769|ALBU_BOVIN Serum albumin - Bos taurus (Bovine).
MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPF
DEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEP
ERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYY
ANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVA
RLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKE
CCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRR
HPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEK
LGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLIL
NRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLP
DTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVV STQTALA
Number of amino acids: 594 Molecular weight: 68026.9 Theoretical pI: 5.77
Informations obtenues sur Expasy
Michaud et al (2008)
Spectrométrie de Masse – analyse de
protéines par MSMS
Dissociation nomenclature fragment
proposée par Roepstorff, 1984
MS spectrum
m/z
MS/MS ion
spectrum
m/z
(Yates, 1998; Westermeier et Naven, 2002; Graves, 2002)
Albumine: fragments trypsiques
position
mass
peptide sequence
position
mass
peptide sequence
25-28
500,2463
DTHK
300-309
1177,5591
ECCDKPLLEK
29-34
712,3736
SEIAHR
310-318
1015,4877
SHCIAEVEK
37-44
974,4577
DLGEEHFK
319-336
1955,9596
DAIPENLPPLTADFAEDK
45-65
2435,2427
GLVLIAFSQYLQQCPFDEHVK
341-346
752,3573
66-75
1163,6306
LVNELTEFAK
347-359
1567,7427
DAFLGSFLYEYSR
76-88
1349,546
TCVADESHAGCEK
361-371
1283,7106
HPEYAVSVLLR
89-100
1362,6722
SLHTLFGDELCK
375-386
1388,5708
EYEATLEECCAK
101-105
545,3405
VASLR
387-399
1497,6314
DDPHACYSTVFDK
106-117
1364,4803
ETYGDMADCCEK
402-412
1305,7161
HLVDEPQNLIK
118-122
658,3155
QEPER
413-420
1011,42
123-130
977,4509
NECFLSHK
421-433
1479,7954
LGEYGFQNALIVR
131-138
886,4152
DDSPDLPK
438-451
1511,8427
VPQVSTPTLVEVSR
139-151
1519,7461
LKPDPNTLCDEFK
460-468
1052,4499
CCTKPESER
157-160
537,282
FWGK
469-482
1667,8131
MPCTEDYLSLILNR
161-167
927,4934
YLYEIAR
483-489
841,46
169-183
1888,9268
HPYFYAPELLYYANK
490-495
660,3563
TPVSEK
184-197
1633,6621
YNGVFQECCQAEDK
499-507
1024,455
CCTESLVNR
198-204
701,4014
GACLLPK
508-523
1823,8996
205-209
649,3338
IETMR
524-528
609,2878
212-218
703,4097
VLASSAR
529-544
1850,8993
LFTFHADICTLPDTEK
223-228
649,3338
CASIQK
549-557
1014,6193
QTALVELLK
229-232
508,2514
FGER
558-561
509,3194
HKPK
236-241
689,3729
AWSVAR
562-568
818,4254
ATEEQLK
249-256
922,488
AEFVEVTK
569-580
1399,6926
257-263
789,4716
LVTDLTK
581-587
725,2593
267-280
1578,5981
ECCHGDLLECADDR
588-597
1050,4924
EACFAVEGPK
281-285
517,298
ADLAK
598-607
1002,583
LVVSTQTALA
286-297
1386,6206
YICDNQDTISSK
NYQEAK
QNCDQFEK
LCVLHEK
RPCFSALTPDETYVPK
AFDEK
TVMENFVAFVDK
CCAADDK
Analyse LC et MS1 de l'albumine trypsique
ANALYSE MS2, cliquez ici
Identification de protéine, cliquez ici
(Logiciel Mascot, Matrix Science)
Protéomique du sérum sanguin
•60 à 80 g/L de
protéine (Tirumalai
et al., 2003)
•10 000 protéines
différentes
•22 protéines =
99% de la quantité
protéinique du
sérum (Zhang et
al., 2005)
•12 log de variation
de concentration
(Anderson et
Anderson, 2002;
Zhang et al., 2005)
Tirumalai et al., 2003
Ex: protéomique du sérum sanguin
Anderson et Anderson, 2002
Microscopie de cellules vivantes
Imagerie hyper-spectrale