Transcript La fluorescence Application à la biologie

La fluorescence
Application à la biologie
La fluorescence
I.
Principe de la fluorescence
II. Microscopie à épifluorescence
Généralités
• Les fluorophores sont avant tout des chromophores
• Les chromophores sont des constituants moléculaires qui absorbent
la lumière hc/λ1,
Ce sont en général des composés aromatiques.
4n+2 e-
• Excités,les fluorophores peuvent, eux, émettre de la lumière à une
longueur d’onde différente hc/λ2
Qu’est-ce qu’une molécule fluorescente ?
La fluorescence est caractérisée par des transitions électroniques
entre un état singulet fondamental et l'état singulet excité.
La durée de vie moyenne de l'état excité est de l'ordre de 10-9 à 10-7 s
GFP : τ = 2,1 ns
Perte d’énergie
e-
Photon
(lumière d'excitation)
Émission de fluorescence,
de plus faible énergie
(plus grande longueur d’onde)
Diagramme de Jablonski (simplifié)
S1
ENERGIE
T1
ABS
FL
Relax th
Photoblanchiement
Phosp
S0
Eexc = Eem + chaleur (Eexc > Eem)
E = (hc)/ l

λexc < λem
Les molécules fluorescentes
utiles en biologie
• Des protéines
• De petites molécules aromatiques
• Des nanocristaux de semiconducteurs
EBFP
ECFP
EGFP EYFP DsRed
HcRed
100
Intensité
mRFP1
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
HcRed
0
350
400
UV
450
500
550
mRFP1
EBFP ECFP EGFP EYFP DsRed
600
400
UV
bleu
vert orange rouge
Longueur d’onde (nm)
450
bleu
500
550
600
650
700
vert orange rouge
Longueur d’onde (nm)
IR
Ex (nm)
Em (nm)
ε (M-1. cm-1)
F
wtGFP neutre
395
508
25-30 000
0,79
wtGFP phénolate
475
503
9,5-14 000
EBFP
380
440
31 000
0,18
5 600
bleu
ECFP
434
477
26 000
0,40
10 000
cyan
EGFP
488
509
55 000
0,60
33 000
5,5
vert
EYFP
515
529
80 400
0,61
49 000
6,9
jaune
Venus YFP
510
530
92 000
0,57
52 000
6,0
insensible Cl
DsRed ; DsRed2
558
583
57 000
0,79
45 000
4,7
Discosoma striata
mRFP1
584
607
44 000
0,25
11 000
4,5
DsRed monomère
HcRed1 ; HcRed-2A
588
618
fluorescéine
490
520
Quantum Dot 405/605
605
brillance (ε . UA)
21 600
pKa
Remarque
4,5
Aequorea victoria
Aequorea victoria
~9 400
GFP
Heteractis crispa
faible
80 000
2 400 000
Absorption
0,90
-1
72 000
0,40
Rendement
Q 1 000 000
6,3
à valider
Représentation d’une protéine fluorescente
tétramérique (asFP595)
Chromophore
(GFP) :
-S-Y-G-
Maturation post-traductionnelle du
fluorophore de la GFP
Les marquages en immunofluorescence
fluorochrome
Anticorps secondaire
Anticorps primaire
Antigène
Echantillon
Coupe semi-fine
Représentation d’un fluorophore inorganique
(Alexa 568)
Exemple de quadruple marquage
DAPI
ex
em
Alexa 488
TRITC
Cy5
UV
400
500
600
700 nm
IR
Fluorescence (% valeur initiale)
Photoblanchiment (photobleaching, fading)
Alexa 488
Oregon Green 514
BODIPY
Oregon Green 488
Fluorescein
Temps
(secondes)
Spectre
continu
Trajet optique
Microscope droit
Observation en
lumière transmise
Observation en fluorescence
avec un jeu de filtre spécifique
de la GFP
Observation en fluorescence
avec un jeu de filtre
spécifique de l’Alexa 568.
Exemple d’image en épifluorescence
(dendrites de neurone P-GFP)
C’est tout et c’est déjà pas
mal !!!!
Principaux fluorochromes utilisés en microscopie
en épifluorescence et confocale
- immunofluorescence :
FITC, TRITC, lissamine rhodamine,
Texas Red, Cy3, Cy5, Alexa Fluors
- ADN :
iodure de propidium, YOYO, Syto16,
chromomycine A3, mithramycine; DAPI,
Hoechst, DRAQ5, TOTO3
- mitochondie : sensible au potentiel
membranaire
Rhodamine 123, DiOC6(3), DiOC7(3),
JC-1, MitoTracker Red CMXRos (postfixation possible)
- réticulum endoplasmique:
(non spécifique) DiOC6(5), GFP-taggée
- appareil de Golgi : GFP-taggée,
anticorps, NBD-C6-ceramide (pas pour
végétaux)
- dépendance envers le pH :
carboxy-SNARF-1, BCECF
- dépendance envers le calcium :
Fluo-3 ou -4 (± FF), FuraRed,
CalciGreen, Indo-1, Cameleon
- membranes :
FM1-43, FM4-64, fusions-GFP, divers
anticorps de surface
- divers :
Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer
Yellow, chlorophylle,
- Viabilité : FDA, exclusion d’iodure de
propidium,… morphologie, avec DIC
- Protéines Autofluorescentes
Quelques documents
• Wikipedia http://fr.wikipedia.org/wiki/Fluorescence
• Live Cell Imaging (Goldman&Spector, Cell Press)
• Invitation à la fluorescence moléculaire (Valeur, De Boeck)
• Cell Imaging Techniques (Mossman, Brooke, Taatjes, Douglas,
Humanan Press)
• Fluorescence microscopy (Rost , Fre, Cambridge University Press)
Bonus
• GFP photoactivable, photoconversion
• Quantum dots
Les paramètres caractéristiques d’un fluorophore :
http://fr.wikipedia.org/wiki/Fluorescence
• Spectre d’absorption : capacité à absorber la lumière (chromophore)
caractérisé par son maximum
e-
• Spectre d’émission : capacité à émettre de la lumière après excitation
caractérisé par son maximum
• Décalage de Stokes : mesure l’écartement des deux spectres précédents, en général on
préfère les fluorophores ayant un grand « Stokes shift »
• Coefficient d'extinction molaire ε : il mesure la quantité de lumière absorbée par mole
de fluorophore (excitabilité) (λ donné)
• Rendement quantique Φ : probabilité qu’un fluorophore excité émette un photon
(efficacité de fluorescence)
0<Φ<1
• Brillance : proportionnelle à la quantité de lumière émise par fluorescence à une lumière
d’excitation donnée. B = ε x Φ
• Cinétique de photoblanchiment : sensibilité du fluorophore
• Durée de vie à l’état excité (pour certaines applications)
Photo-activation
exemple : PA-GFP
Ando, Ryoko et al. (2002) PNAS. 99, 12651-12656
Quantum dot:
particule fluorescente non aromatique !!!
Core nanocrystals with size
between 3-8 nm
(CdSe, CdTe, CdS, ZnSe)
anorganic shell
(ZnS, CdS)
organic shell (silica/siloxane,
phospholipides, proteins)
10 - 15 nm
Ordre de grandeur - Q-dot
Propriétés
Brillance = ε.ΦF
• Forte brillance
eGFP
33 000
Q Dot
1 000 000
bleach resistance of Q-Dots
• Résistance au photoblanchiement
• Clignotement
emission intensity
Alexa 488
300
sampling rate 26.7 Hz
Q-Dot
200
100
0
• Large gamme de spectre accessible en excitant
dans le domaine UV
20
40
60
t (s)
Exemple d’application :
suivi de molécules uniques
1 μm