Transcript PCRq - cours

La PCR en temps réel
Exemple d'utilisation au laboratoire
de Bactériologie de l'hôpital Pellegrin
Sabine Pereyre
PCR conventionnelle
ADN, amorces, dNTP, Taq pol
Dénaturation (95°C)
30 - 35 cycles
Hybridation des amorces
Taq
Taq
Elongation (72°C)
PCR conventionnelle
1- Extraction (manuelle ou automatisée)
2- Amplification
Taq Taq
3- Révélation : Electrophorèse sur gel d'agarose (1-2%)
-
+
Cinétique de la PCR
Cinétique de la PCR
Phase plateau
Phase exponentielle
PCR conventionnelle versus en temps réel
PCR en temps réel
- Haute précision pendant la phase exponentielle
- Variabilité importante à la phase plateau
PCR "classique"
en point final
PCR en temps réel
Basée sur la détection d'un "reporter" fluorescent
 Signal proportionnel à la quantité d'amplicons
 Signal détecté "en temps réel"
1- Extraction (manuelle ou automatisée)
2- Amplification et détection synchronisée
Système fermé, pas de manipulation post-amplification
● Rapidité
● Faible risque de contamination
PCR conventionnelle versus en temps réel
PCR conventionnelle
Gel d'agarose
PCR en temps réel
Courbe de fluorescence
PCR en temps réel - Quantification
Valeurs de fluorescence corrélées à la quantité de produit amplifié
 Concept de "cycle seuil" (Ct) : base de la quantification
Ct ( Cycle threshold)
=
nombre
de
cycle
d'amplification nécessaire
pour obtenir un signal
fluorescent statistiquement
significatif par rapport au
bruit de fond (valeur seuil).
Seuil fixé
au
dessus
du bruit
de fond
 Plus le Ct est petit, plus l'échantillon est concentré
Dérivée de la fluorescence
Ct
Nbre de cycles
Nombre de copies (log)
Fluorescence émise (UA)
Quantification – courbes de calibration
250
200
150
100
106
Ct
50
105 104 103 102 101
1
0
0
10
20
30
Nombre de cycles
40
6
5
4
3
2
Log N = -0,26 Ct + 10,85
R2= 0,998
1
18
23
28
33
Cycle seuil - Ct
Echantillon
Inconnu : Ct =25
38
Génération de la fluorescence
1- Agent se liant à l'ADN double brin :
● STBR Green I
2- Utilisation de sondes
● Hydrolyse de sondes : sondes Taqman
● Hybridation de deux sondes : FRET (Fluorescence Resonnance
Energy Transfert)
● Molecular Beacons (balises moléculaires)
Principe du SYBR Green I
= Agent intercalant dont l'émission de fluorescence augmente
lorsqu'il est lié à l'ADN double brin
Avant amplification
Après amplification
h‫ע‬
h‫ע‬
SYBR Green
Le SYBR Green en solution
émet peu de fluorescence
F
F
ADN double brin
Durant l'élongation, il se fixe sur l'ADN
double brin naissant, entraînant une
augmentation de la fluorescence
Principe du SYBR Green I
L'émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque cycle d'élongation
(l'émission de fluorescence décroît lorsque l'ADN est dénaturé à l'étape suivante)
SYBR Green Avantage - Inconvénients
Avantage
- Economique
- Facile d'utilisation
- Pas d'expertise particulière pour le design de sondes
fluorescentes
- Non affecté par des mutations de l'ADN cible (qui affectent
l'hybridation des sondes spécifiques)
Inconvénients
- La spécificité repose entièrement sur les amorces
- Faux positifs, surestimation de la quantification (le SYBRgreen
se fixe à n'importe quelle molécule d'ADN double brin y compris
des produits non spécifiques ex : dimères d'amorces, mauvais
appariements)
 Analyse de la courbe de fusion indispensable
Analyse de la courbe de fusion
- Chaque produit d'amplification est caractérisé par son Tm
(température de fusion = melting temperature)
= température pour laquelle 50% de l'ADN double brin est
dissocié
- Le Tm d'un produit d'amplification est mesuré en suivant
l'évolution de la fluorescence lorsque la température augmente
- Deux produits de PCR diffèrent par leur Tm
 il est possible de détecter des produits non-spécifiques, des
dimères d'amorce
Dérivée de la fluorescence
Analyse de la courbe de fusion
Température °C
Tm =87°C
SYBR Green
Courbe de fusion
Fluorescence
Fluorescence
Courbe d'amplification
Nombre de cycles
Ct : quantification
Température °C
Tm : spécificité du produit
d'amplification
Génération de la fluorescence
1- Agent se liant à l'ADN double brin
● SYBR Green I
2- Utilisation de sondes
● Hydrolyse de sondes : sondes Taqman
● Hybridation de deux sondes : FRET (Fluorescence Resonnance
Energy Transfert)
● Molecular Beacons (balises moléculaires)
Sondes Taqman - Principe
Hybridation d'une sonde spécifique
Composition de la sonde
● Fluorochrome émetteur (reporter) en 5'
Ex : FAM 6-carboxy-fluorescein
● Fluorochrome suppresseur (quencher)
en 3' ex : TAMRA 6-carboxy-tetramethylrhodamine
 pas d'émission de fluorescence
Sondes Taqman - Principe
Cette méthode repose sur deux principes :
- la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer)
- l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol
Reporter
Quencher
FAM, VIC
TAMRA
FP
3’
5’
3’
5’
RP
 Spécificité des amorces pour la PCR
 Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan
Sondes Taqman - Principe
Lumière
3’
FP
R
Q
5’
3’
5’
RP
- FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le
reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie),
pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la
sonde est intacte
3’
FP
Q
5’
5’
3’
RP
- au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’
nucléase coupe la sonde  libération du reporter
Q
3’
5’
FP
5’
3’
RP
- lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule
d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.
 La fluorescence est proportionnelle aux taux d'hydrolyse de la sonde
hybridée donc à la quantité de produit d'amplification
Sondes Taqman
Avantage :
- Spécificité accrue
Spécificité des primers pour la PCR
Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan
- Possibilité de multiplexage avec des sondes portant des
fluorochromes différents
Inconvénient :
- Impossibilité de réaliser des courbes de fusion
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
● Utilisation de 2 sondes linéaires complémentaires d'une séquence cible
- Une sonde marquée en 3' par un marqueur fluorescent, qui émet une
fluorescence verte
- Une sonde marquée en 5' par un fluorochrome accepteur, qui émet une
fluorescence rouge
● Hybridation "tête à queue " sur l'ADN cible  proximité des fluorochromes
Transfert d'énergie  fluorescence rouge
En solution, bruit de fond de
fluorescence verte
Pendant l'hybridation,
fluorescence verte
FRET
Hybridation
Dénaturation
Elongation
 L'acquisition du signal se fait pendant l'hybridation. L'accroissement de
fluorescence rouge est proportionnel à la quantité d'ADN synthétisé
Molecular beacons
= sonde d'hybridation en épingle à cheveux appelée balise moléculaire
- Une boucle : séquence complémentaire d'une séquence cible de l'ADN
- Deux bras de séquences complémentaires
- Un fluorochrome émetteur (ex : FAM, ROX, TET)
- Un fluorochrome suppresseur, non fluorescent. Il dissipe l'énergie de
l'émetteur en chaleur (FRET)
Fluorochrome émetteur
Fluorochrome suppresseur = quencher
Molecular beacons
1- Dénaturation
2- Hybridation
balises libres : pas de
fluorescence
La sonde s'hybride
préférentiellement à sa
séquence cible complémentaire
sur la matrice
Emission de fluorescence
3- Elongation
Libération de la balise : pas de
fluorescence
Molecular beacons
Avantages
- Très spécifique : détections des SNP (Single Nucleotide
Polymorphisms)
Si la séquence cible ne correspond pas parfaitement à la balise
moléculaire, pas d'hybridation donc pas d'émission de fluorescence
(formation en épingle à cheveux thermodynamiquement plus stable)
Inconvénient
- Difficulté du design des sondes d'hybridation
Les appareils de PCR en temps réel
LightCycler (Roche Diagnostics)
Utilisation de fins capillaires
en verre permettant une
optimisation des échanges
thermiques
 Rotor de 32 places
GeneAmp 5700 et Prism 7000 (Applied Biosystems)
GeneAmp 5700
ABI Prism 7000
 Réactions en plaque de 96 puits
COBAS Taqman (Roche Diagnostics)
COBAS Taqman 48
(48 tests)
Icycler (BioRad)
 Réactions en plaque de 96 puits
MX4000 (Stratagene) et Rotor Gene (Corbett Resesarch)
MX4000
Rotor Gene
SmartCycler (Cepheid)
 Tubes réactionnels conçus
pour optimiser les échanges
thermiques et la sensibilité
optique
 Chaque tube peut fonctionner
avec un programme indépendant
Principaux appareils de PCR en temps réel
Avantages PCR en temps réel /PCR conventionnelle
PCR conventionnelle
PCR temps réel
Préparation de l'échantillon
(lyse de l'organisme,
purification des AN)
Manuel
Automatisé
Manuel
Automatisé
Amplification et détection
Plusieurs étapes
Système ouvert
Intégré
Simultané
Système fermé
Système de détection
Gels
Radio-isotopes
Enzymes
Fluorochromes
Temps d'analyse
4h à 48h
20 min à 2h
Taux de contamination
Moyen à fort
Faible
Taux de quantification
2-3 log
5-6 log
Reproductibilité
Bonne intra-labo
Mauvaise inter-labo
Grande (théoriquement)
Traçabilité
Coût
Détection, enregistrement et
analyses intégrés
Gel : 4-5 euros
SYBR Green : 4-5 euros
Sondes : 10 euros
Apport de la PCR en temps réel en Bactériologie
1- Diagnostic bactériologique
PCR qualitative ou quantitative
2- Etude de la résistance aux AB
3- Typage bactérien (génotypage)
1- Diagnostic bactériologique
Exemple 1: Mycoplasma pneumoniae (TP jeudi)
- Bactérie responsable d'infections respiratoires chez l'enfant et
l'adulte jeune
Culture difficile, peu sensible, en 3 semaines
Antibiotiques classiquement utilisés (β-lactamines) inactifs
A Pellegrin
Extraction automatisée (MagNAPure, Roche diagnostic)
PCR en temps réel Taqman sur ABI Prism 7700, gène de l'adhésine P1
pur
10-1
10-2
10-3
Témoin + : culture de Mpn extraite et amplifiée pure, 1/10ème, 1/100ème, 1/1000ème
Patient
En rouge : patient positif pour M. pneumoniae
Diagnostic bactériologique
Exemple 2 : Chlamydia trachomatis (TP vendredi)
- Bactérie responsable d'infections génitales souvent inapparentes
chez l'homme et la femme. Complications: stérilité féminine
Bactérie intracellulaire  culture cellulaire difficile
 A Pellegrin
Extraction
automatisée
(MagNAPure, Roche diagnostic)
- PCR en temps réel Taqman sur
COBAS Taqman
Diagnostic bactériologique
Exemple 3 : Neisseria meningitidis (méningocoque)
- Bactérie responsable de méningites graves. Diagnostic et
traitement antibiotique sont une urgence vitale.
Nécessité d'une prophylaxie pour l'entourage (AB ou vaccin)
la culture bactérienne nécessite 24 heures
 A Pellegrin
- Culture classique
- PCR en temps réel SYBR Green (gène ctrA, Pr de mb externe)
Amplification du gène ctrA de N. meningitidis
Témoin +
patient
Témoin +
eau
patient
Diagnostic bactériologique à Pellegrin
Gènes
Principaux
échantillons
Extraction
Amplification1
Intérêt
M. pneumoniae
Adhésine P1
(P de mb)
Respiratoires
MagNA Pure
TaqMan
Culture difficile
C. pneumoniae
PMP4
(P de mb)
Respiratoires
MagNA Pure
TaqMan
Culture
exceptionnelle
IncA (P mb
d'inclusion)
respiratoires
MagNA Pure
Taqman
Culture facile mais
secteur protégé P3
C. trachomatis
Plasmide
cryptique
Génitaux
Urine
MagNA Pure
-COBAS Amplicor
-Taqman (COBAS
Taqman)
Culture difficile
(cellulaire)
M. genitalium
Adhésine MgPa
Génitaux
Urine
SYBR Green puis
Taqman
Culture impossible
ARNr 16S
Respiratoires
LCR, divers
Kit COBAS
ctrA (P de mb
externe)
LCR
Manuelle2
IS 481
IS 1001
Respiratoires
Fragment sa442
mecA
Germes
C. psittacci
M. tuberculosis (BK)
N. meningitidis
B. pertussis
B. parapertussis
S.aureus (+/- mecA)
PCR universelle 16S
(pt fragment bactérien)
PCR universelle 16S
(grand fragment)
1Amplification
2Extraction
MagNA Pure
COBAS Amplicor
(PCR ELISA pt final)
Culture très lente
SYBR Green
Diagnostic
d'urgence
MagNA Pure
SYBR Green
Culture difficile
Souche isolée
Manuelle2
SYBR Green
Si identification
difficile
ARNr 16S
Prélèvements
divers
Manuelle2 ou
MagNAPure
SYBR Green
Contrôle
d'extraction
ARNr 16S
Souche isolée
Manuelle2 ou
MagNAPure
SYBR Green
Identification
bactérienne
par PCR en temps réel sauf COBAS Amplicor
manuelle avec un tampon de lyse (Triton, Tween, Tris-EDTA)  Ebullition 10 min  centrifugation  surnageant
2- Etude de la résistance aux antibiotiques
Exemple : Etude de la résistance à la clarithromycine chez H.pylori
H.pylori : bactérie responsable de l'ulcère gastro-duodénal
Clarithromycine: AB utilisé en association en 1ère intention
Résistance par mutation ponctuelle d'une base de
l'ARNr23S, cible de cet AB (20% des souches)
 A Pellegrin
PCR en temps réel, FRET
sur Lightcycler
2- Etude de la résistance aux antibiotiques
FRET: Hybridation "tête à queue " sur l'ADN cible  proximité des
fluorochromes  Transfert d'énergie  fluorescence rouge
Mutation
- S'il y a une mutation sur l'ADN cible, la sonde (rouge) est moins
bien hybridée
- Si on augmente la température, elle se détachera plus facilement
 Réalisation de courbes de fusion
Température
basse
moyenne
Fluorescence
Fluorescence si
hybridation parfaite
mais pas si mutation
élevée
Hybridation
parfaite
Mismatch
(mutation)
Pas de fluorescence
Sauvage
Mutations
AAG
ACA
AAA
AGA
 Si mutation, le Tm est plus faible
 Technique réalisable directement à partir des biopsies gastriques
3- Typage bactérien
- Typage bactérien : identifier les différents "types" ou les différentes
souches d'une espèce bactérienne
- Intérêts nombreux
Ex : identifier une épidémie liée à une même souche
Ex : identifier un type plus virulent, résistant aux AB , etc…
Exemple : typage des souches de méningocoque à Pellegrin
- Il existe plusieurs sérogroupes : A, B, C, Y, W135
 Des vaccins existent contre les sérogroupes A, C, Y, W135 mais
pas contre le sérogroupe B
- Objectif du typage : si diagnostic de N. meningitidis, peut-on
vacciner les sujets contacts? Si oui, avec quel vaccin?
Détermination du sérogroupe de N.meningitidis
- Amplification du gène siaD (biosynthèse de la capsule des
sérogroupe B, C, Y et W135) ou ou mynB (biosynthèse des
polyosides de capsule du sérogroupe A).
- Amorces spécifiques, différentes selon les sérogroupes
- PCR temps réel SYBR Green sur ABI prism 7000
durée 2-3 heures
Recherche du sérogroupe B
Témoin +
patient
Recherche du sérogroupe C
Témoin +
patient
Confirmation : analyse de la courbe de fusion
patient
Témoin +
Recherche du sérogroupe W135
Témoin +
patient
Conclusion
Avantages de la PCR en temps réel
● Automatisation
● Rapidité
● Spécificité
● Sensibilité
● Faible risque de contamination
Place dans un laboratoire de Bactériologie
● Diagnostic de bactéries non ou difficilement cultivable
● Diagnostic d'urgence
● Etude de la résistance aux AB de bactéries difficilement
cultivables
● Typage moléculaire