Transcript Les techniques de la biologie moléculaire

Les techniques de la biologie
moléculaire
Introduction
• "Chercher une aiguille
dans une meule de
foin" ?
• Chercher à repérer un
gène particulier dans
un génome entier, qui
en contient jusqu'à
des centaines de
milliers, c'est un peu
comme chercher une
aiguille dans une meule
de foin...
• La réponse a ce problème :
Les techniques de la biologie
moléculaire
L’électrophorèse
L’électrophorèse des acides
nucléiques
• Déplacements de fragments
d’acides nucléiques chargés selon
leur taille sur un gel soumis a un
champ électrique
Le gel utilisé
L’agarose pour
les fragments d’ADN
de taille
(0,5-20kb)
L’acrylamide pour les
fragments de moins
de 1000 paires
de base
L’électrophorèse en
champs alternées
Principe
• On change périodiquement
l’orientation du champ par a port au
gel ,lors du changement de
l’orientation du champ électrique
l’acide nucléique change le sens de
son orientation .
Visualisation par autoradiographie
But
Séparer, analyser ou purifier des
acides nucléiques
Remarque
• Les fragments d’acides nucléiques
peuvent être séparer selon leur
structure ;par exemple les
différents formes d’un plasmide
(ouvert ,linéaire ,surenroulé)
Remarque
• Elle permet aussi d’étudier des
interactions des acides nucléiques
avec des protéines
La centrifugation
Centrifugation en gradient de
saccharose
• Principe:
Séparer les macromolécules •
selon leur poids moléculaire et/ou leur
forme
Utilisations majeurs
• Purification des phages
• Sélection des fragments d’ADN
voulus
• Isolement des polysomes
• Fractionner les ARN (ARNm,
ARNt,…)
Un exemple d'utilisation
de la centrifugation
zonale : le
fractionnement de
molécules d'ARN
Centrifugation en gradient
de chlorure de césium
1. /Centrifugation isopycnique (gradient
continu)
Utilisation d’une:
Solution de chlorure de césium(CsCl)
Utilisations majeurs
• Préparation de plasmides et de
phages
Exemple: La purification des
plasmides
2/ .Centrifugation sur
coussin (gradient
discontinu)
Utilisation majeure
• préparation rapide et à grande
échelle des phages ou des virus de
densité connue.
• Un exemple d'utilisation de la
centrifugation sur coussin : la
purification des phages
La PCR
Historique
• En 1960 dans les sources de
Yellowstone aux U.S.A. « Thermus
aquaticus » est découverte vivant
à 70°C, trente ans plus tard son
ADNpoly <Taq > est utilisée dans la
PCR
• (La revue Sciences décernait sa 1ere distinction de
molécule de l’année à la Taq polymérase)
Définition
• PCR « polymérase chain reaction »)
technique d’amplification in vitro
mis au point par le chimiste Kary
MULLIS en 1985 ( Prix Nobel
1993)
Principe
Faire progresser nos capacité
d’analyse des gènes
Composés utilisés
•
•
•
•
L’ADN matrice
Amorces d’oligonucléotides
Une ADN polymérase
Des désoxyribonucléotides
triphosphate (dNTP)
Déroulement des cycles
d’amplification
• La dénaturation
• L’appariement des primers
• Elongation
Schéma de la PCR
Applications
La PCR a apportée d’importantes
contributions dans beaucoup de
domaines:
• Les maladies héréditaires
• La recherche contre le cancer
• Les sciences médico-légales
• Les biotechnologies
L’hybridation
Généralités
Les techniques de l’hybridation
reposent sur :
Complémentarité des
bases successives de
l’ADN
La réversibilité du
processus de
séparations deux
brins d’ADN
Les cas possibles pour
une hybridation
1. Hybridation stable (100%)
2. Pas d’hybridation
3. Hybridation partielle (50%)
But
Repérer une molécule d’ADN ou d’ARN
spécifique dans une
population hétérogène
Les différentes
techniques d’hybridation
• Hybridation ADN/ADN : Southern
blotting
• Hybridation ARN/ADN : Northern
blotting
• Hybridation Dot-blotting et slotblotting
Southern
• Sonde
ADN
• Cible
ADN
(nucléaire,
phagique
plasmidique ou
autres,…)
Northern
• Sonde
ADN
• Cible
ARN
Dot-blotting & Slotblotting
• Sonde
ADN
• Cible
ARN ou ADN
Monocaténaire
Conclusion
• Grace aux techniques de la biologie
moléculaire les chercheurs ont pu
établir une partie de la carte des
gènes humains, et espèrent obtenir le
séquençage de tous le génome humain
a des fins thérapeutique, médicales, a
titre de prévention
Référence
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
*Cours de l’institut national de recherche pédagogique
*Biologie moléculaire PCEM 1 2006-2007 Université de Paris –VI Faculté
de Médecine Pierre et Marie Curie
*Comprendre la biologie moléculaire V. Laudenbach’, (2), J. Mantz(1), J.M.
Desmontsl(1) (1) ‘Département d’anesthésie-réanimation chirurgicale,
hôpitaux Bichat-Claude Bernard-Robert Paris ;
(2)Laboratoire de neurologie du développement Paris
* Thèse de Licence d’informatique Année 2001-2002 Option : Introduction
à la biologie moléculaire
*Principes des techniques de biologie moléculaire 2° édition Par D. Tagu,
C.Moussard, éds (I.N.R.A. de Paris)
*Article du magazine La recherche édition spéciale < Les frontières du
vivant > N°317 Février 1999
* Participation à l’établissement d’une phylogénie moléculaire de requins
d’eau profonde de l’ordre des Squaliformes de L’Université de Nantes
Département Sciences et Techniques Alimentaires Marines
*L’essentiel en génétique Edition : BERTI
*Biochimie génétique biologie moléculaire de Jacqueline Etienne & Eric
Clauser Edition Masson
*Principe de génie génétique 6° édition ; édition De Boeck