Transcript Bio57 Séance de Révision 9 décembre 2011

Bio57 Séance de Révision 9 décembre 2011
1. La transgenèse/KO souris
2. Les plantes transgèniques
3. Les techniques de blotting
4. Les puces ADN
La Transgenèse
Knockout Mice et Les Cellules Souches
Gene Targeting
Exemples des souris knockout
1. Le gène Sry
2. Le gène p53
3. Le gène Myo D et la redondance
Cre-lox recombinaison
•Le système cre-lox :
1.Est important pendant l’épissage chez les
eucaryotes
2.Est un système de recombinaison
3.Est utilisé toujours pour effacer les
promoteurs des gènes
4.Peut être utilisé avec un promoteur
inductible
•Les étapes suivantes sont essentielles
pendant la production d’une souris
transgénique :
1.Injection du transgène après la première
division cellulaire
2.Incubation des embryons injectés à 37°C
pendant la nuit après les injections
3.Accouplement des femelles avec des mâles
vasectomisés
4.Injection des femelles avec un œstrogène
•Pour faire une souris knock-out il faut :
1.injecter un gène dans un ovocyte
2.utiliser des cellules germinales
3.toujours effacer tous les exons du gène ciblé
4.utiliser G418 pour sélectionner pour la
présence du gène Neo
Les Plantes Transgèniques
Smith et Townsend montrent en 1907 que le crown-gall est causé par une
bactérie Agrobacterium tumefaciens
Comment la bactérie entraîne une multiplication incontrôlée des cellules
végétales ?
Réponse trouvée par la découverte des hormones végétales et de l’utilisation
de la technique de culture in vitro
Deux familles d’hormones permettent aux cellules végétales de se multiplier
indéfiniment en culture in vitro
Les auxines et les cytokinines
Les agrobactéries hébergent de très grands plasmides (200 kb) nécessaires à la
formation des tumeurs
ADN circulaire extrachromosomique, autonomie de réplication, plusieurs
exemplaires par cellule, plasmide appelé Ti pour Tumor inducing
Rôle des auxines et des
cytokinines dans l’organogenèse
Le rapport auxines / cytokinines
détermine le devenir des tissus en
culture
Notion de balance hormonale
En concentrations égales division
de cellules indifférenciées = cals
Auxine formation de racines
Cytokinines bourgeons
Un vecteur binaire ( version modifiée du plasmide Ti) est utilisé
pour transformer l’ Agrobactérium.
Les gènes qui produisent des hormones-qui donnent les cals-ne
sont plus présents. Remplacés par le gène qu’on veut mettre
dans les plantes.
Il faut des gènes de sélection:
1. sélection pour les Agrobacterium transformés et
2. pour les cellules des plantes qui ont été transformés par le
plasmide.
Donc:
1. Transformation d’agrobactérium avec le vecteur binaire:
sélection avec des antibiotiques
2. Transfer du plasmide vers les cellules des plantes: sélection
avec un herbicide ou un antibiotique
Intégration du gène dans le génome du plante est aléatoire
Nombreux domaines d’application
Agriculture
Agroalimentaire
Industries
Environnement
Santé-pharmacie
Introduction de caractéristiques
nouvelles et production de
molécules d’intérêt
Le code génétique est universel,
pas de barrière d’espèces
Agriculture
Résistance aux stress (chaleur, froid, sécheresse et salinité)
Permettre la culture en conditions environnementales non favorables
Résistance aux insectes…
Agroalimentaire
Introduction de caractères pour obtenir des avantages nutritionnels, gustatifs
Riz doré (golden rice) carence en vitamine A(antioxydant), 400 millions de personnes
(cécités,
sensibilité accrue aux infections)
Introduction de 4 gènes synthèse de B-carotène (précurseur de la Vit A)
Industrie
Industrie papetière, papier à partir de cellulose du bois,
Présence de lignine, imperméable et inextensible très coûteux à
éliminer et source de pollution (utilisation de chlore et consomme une
très grande quantité d'eau)
Diminution du taux de lignine par transgénèse
Biocarburants
Vaccins
Et plus……..
•Lors de la transgénèse végétale :
1.on réalise une co-culture des cellules végétales et
d’agrobactéries
2.100% des cellules végétales sont infectées par les
agrobactéries
3.on utilise des hormones végétales
4.on utilise des anti-fongiques
•La galle du collet
•est une infection virale qui provoque une chlorose chez les
plantes
•pose des problèmes en sylviculture
•correspond à l'obtention de cellules végétales transgéniques
•est une infection bactérienne qui produit une tumeur chez
les plantes
•Lors de la régénération de plantules à partir de cals :
•un excès d'auxines par rapport aux cytokinines entraine la
formation de bourgeons
• un excès d'auxines par rapport aux cytokinines entraine la
formation de racines
•un excès de cytokinines par rapport aux auxines entraine la
formation de bourgeons
• une concentration équivalente de cytokinines et d'auxines
stimule la division cellulaire
Les Puces d’ADN
Principe de fonctionnement Le concept de biopuce (= puce à ADN) est né
dans les années 1990.
Le principe de la puce à ADN est basé sur la technique d' hybridation .
Immobilisés sur un support solide (matrice), des oligonucléotides (simples
brins) spécifiques de différents gènes ou ADNc connus constituent les
sondes dont le rôle est de détecter des cibles marquées complémentaires ,
présentes dans le mélange complexe à analyser ( ARNm extraits de cellules,
tissus ou organismes entiers et convertis en ADNc).
Les sondes sont soit greffées sur le support, soit synthétisées in situ. Les
signaux d'hybridation sont détectés selon le type de marquage,
radioactivité ou fluorescence, par mesure radiographique ou par
fluorescence, et quantifiés.
Les puces d’ADN
•L'analyse de mutations
A côtéde la séquence sauvage (sonde de référence), on utilise plusieurs sondes
identiques àune mutation prés. l
•Le séquençage par hybridation
L'analyse procède par lecture de petits blocs. L'analyse porte sur des sousséquenceschevauchantes qui sont
lues et réassembléesau moyen d'un programme informatique qui reconstitue la
séquence étudiée.
•Le diagnostic des maladies génétiques
•Le diagnostic des maladies infectieuses
Détection de microorganismes (présence, mutations, capacité à résister à certains
antibiotiques ou à des inhibiteurs d'enzymes).
•La pharmacogénomique
Identification de cibles pour la recherche thérapeutique.
•La toxicogénomique
Dans le cas de l'analyse de la réponse toxicologique àl'aide de puces àADN, on doit au
départ faire l'hypothèse que l'effet toxicologique, direct ou indirect, d'une substance
résulte de la modification de l'expression de certains gènes.
•L'agro-alimentaire
Contrôle des microorganismes utilisés dans certaines fabrication (ferments lactiques,
levures, mycélium, etc...),
•L'environnement
Analyse bactérienne de l'eau de consommation, détection des agents infectieux dans
l'alimentation, l'air ou
l'eau (Salmonella, Listeria, Legionnella).
Vous cultivez des bactéries en présence ou en absence de lactose.
Vous réalisez une hybridation sur puce à ADN en ayant
préalablement marqué les ADNc des bactéries ayant poussé sans
lactose avec un fluorochrome vert, et les autres avec un
fluorochrome rouge.
•les spots correspondant aux gènes exprimés dans les deux
conditions seront colorés en jaune
•les spots correspondant aux gènes non exprimés seront colorés
en jaune
•les spots correspondant aux gènes exprimés qu’en présence de
lactose seront colorés en vert
•les spots correspondant aux gènes exprimés qu’en absence de
lactose seront colorés en rouge
•Les puces à ADN permettent de :
•étudier le protéome
•étudier l’expression des gènes
•étudier le transcriptome
•diagnostiquer certaines maladies
Blotting
• Northern blotting: expression des gènes; taille des transcrits, nombre de
transcrits: sonde normalement ADNc
• Southern blotting: organisation de l’ADN ( plasmides ou ADN génomique)
et sites de restriction: sonde normalement ADNc
• Western blotting: absence ou présence des protéines dans un extrait des
cellules. Peuvent aussi faire la différence entre les formes modifiées ( avec
ou sans phosphate par exemple). Sonde toujours des anticorps
• La stringence: les conditions d’hybridation: concentration de sel,
température, présence de formamide.
• Stringence forte: sel faible, température élevée
• Stringence faible: sel fort, température bas
Northern blot
Southern Blotting
Western Blotting
Les protéines sont séparées sur un gel d’acrylamide, elles sont
transférées sur une membrane utilisant un courant et elles sont
détectées par des anticorps
•Un Northern blot :
•permet de déterminer la présence d’un ARN messager.
•permet de déterminer si l’expression d’un ARN messager est
soumise à des régulations.
•peut-être réalisé indifféremment avec une sonde ARN ou
une sonde ADN.
•est couramment utilisé pour mettre en évidence des
réarrangements chromosomique
•On souhaite réaliser un western blot pour détecter la protéine mGluR
(un récepteur humain du neurotransmetteur glutamate) :
•Dans les premières étapes de l’expérience, on doit purifier des
protéines à partir de cerveau, les dénaturer avec du SDS, puis les
faire migrer sur gel d’agarose.
•Lors de l’étape de transfert des protéines, on réalise le sandwich
dans l’ordre suivant « papiers buvards humides, gel, membrane
de nitrocellulose, papiers buvards humides » puis on place
l’électrode négative du côté de la membrane et la positive du côté
du gel.
•Après l’étape de transfert on peut saturer efficacement la
membrane en l’incubant dans une solution contenant du lait.
•Pour détecter mGluR, il nous faudra produire des anticorps spécifiques
en injectant le récepteur humain mGluR dans un lapin
•Vous réalisez la mise au point de l’étape d’hybridation d’un Southern
blot :
.L’ADN sur le blot et l’ADN utilisé pour préparer la sonde
proviennent des espèces différents donc il faut réduire la
stringence
•Si vous obtenez un fort bruit de fond (bandes aspécifiques) vous
pouvez augmentez la stringence en augmentant la température.
•Pour augmentez la stringence vous pouvez aussi augmenter la
concentration en sel (tampon SSC).
•Si vous n’obtenez aucun signal cela peut signifier que vous avez
choisi des conditions trop stringentes