Transcript Diapositive 1

Le clonage
Les enzymes de restriction
X-gal: sélection bleu-blanc
La production d’une molécule recombinante
La production des molécules recombinantes-suite
• -ligation avec l’ADN coupé avec un seul enzymepeut donner
très peu de recombinantes
• -le rapport plasmide/insert est capital
• -traitement avec une phosphataseplus de recombinantes
• -couper les molécules d’ADN avec 2 enzymesplus de
recombinantes
• -la température de la ligation: 20°C est mieux que 37°C
• -extrémités franches-ligation plus difficile: réduit la
température et augmente le temp de ligation
Digestion avec 2 enzymes
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5’-----AAGCTT------------GAATTC---------3’
3’-----TTCGAA------------CTTAAG---------5’
Plasmide avec une site HindIII et une site EcoR1
Digestion avec les deux enzymes……
5’-----A
AATTC--------3’
3’-----TTCGA
G--------5’
• Une ligase ne peut pas mettre ces deux extrémités ensemble
manque de compatibilité des nucléotides
La transformation des bactéries
-phase exponentiel
-en présence de Ca++ à 4°C
-choque thermique
Gel d’agarose
TP de clonage
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Premier jour
-digestion de l’ADN de la bactériophage lambda et l’ADN de pBS avec des enzymes
Hind III et Eco R1
-inactivation des enzymes de restriction à 70°C
-ligation des produits de la digestion
-électrophorèse des produits de la digestion sur gel d’agarose
-transformation des bactéries compétentes
-étalage des bactéries sur les boîtes de petri amp/x-gal
Deuxième jour
-préparation des plasmides recombinantes
-digestion de l’ADN des plasmides
-électrophorèse des produits de la digestion
-identification des fragments de l’ADN de la phage lambda clonés dans le plasmide