Transcript Amplification des plasmides recombinés et

I) Obtention de l’ADN recombinant
VECTEUR
(fragment d'ADN
capable de
réplication
autonome)
ORGANISME
DONNEUR :
Extraction d'un
fragment d'ADN
d'intérêt
Insertion du fragment
d'intérêt dans le vecteur
Obtention d'un ADN Recombinant
5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu
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5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :
Transformation des bactéries
4) Étalement
sur boîte (pour
la sélection)
1) Mélange de plasmides
et de bactéries
compétentes sur glace
(les bactéries compétentes ont
été traitées pour faciliter l'entrée
d'ADN : leur paroi a été fragilisée
par un traitement au chlorure de
calcium)
(utilisation de Escherichia coli en
général : utilisation facile,
croissance rapide)
3) Ajout de milieu
2) Choc thermique à
nutritif aux bactéries,
42°C : les plasmides
vont pénétrer dans les croissance 1h à 37°C
(cela permet l'expression des
bactéries
protéines de résistance aux
antibiotiques pour la sélection
ultérieure)
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5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :
Sélection des bactéries transformées
Il faut sélectionner les bactéries transformées (celles
comportant le plasmide recombiné)
Colonie de
bactéries
transformées
Mélange de bactéries
transformées contenant le
plasmide d'intérêt et de
bactéries non transformées
Étalement des bactéries sur une boîte contenant
un milieu gélosé et un antibiotique : seules les
bactéries transformées pourront se multiplier
car le plasmide porte un gène de résistance
contre l'antibiotique
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5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :
Extraction du plasmide recombiné
• Ensemencement d’une colonie de bactéries transformées
dans du milieu liquide + antibiotique une nuit à 37°C
=> Multiplication des bactéries et donc amplification du
nombre de plasmides recombinés (cf. présence d'une origine
de réplication bactérienne sur le plasmide, l'antibiotique assure une
pression de sélection pour que les bactéries conservent le plasmide)
• Il faut ensuite récupérer le plasmide
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5 ) Amplification de l’ADN recombinant obtenu :
Extraction du plasmide recombiné
• Les bactéries sont lysées par un détergent en milieu
alcalin afin de libérer l'ADN génomique et plasmidique.
L'ADN génomique et les protéines sont précipités par de
l'acétate de sodium. Le précipité est séparé par
centrifugation, le surnageant contient l'ADN plasmidique.
• L'ADN plasmidique est alors précipité (volume double
d'éthanol ou isopropanol), lavé puis redissous dans un
tampon adéquat. Cette étape peut être réalisée avec des
colonnes de purification d’ADN.
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I) Obtention de l’ADN recombinant
VECTEUR
(fragment d'ADN
capable de
réplication
autonome)
ORGANISME
DONNEUR :
Extraction d'un
fragment d'ADN
d'intérêt
Les bactéries poussant sur le
Insertion du fragment
d'intérêt dans le vecteur
milieu+antibiotique
possèdent un plasmide avec
le gène de résistance à
l’antibiotique. Mais ce
plasmide contient-il l’insert
Obtention d'un ADN Recombinant amplifié
cloné ? Il peut y avoir
religation du vecteur sur luimême. Nécessité d’un crible
6 ) Vérification de la construction
pour trouver les clones
positifs ayant intégré l’ADN à
cloner.
6
6 ) Vérification de la construction
a) Vérification rapide par PCR
Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné
(contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur luimême (2) => il faut distinguer ces deux populations
1
2
PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des
produits formés sur gel d'agarose
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6 ) Vérification de la construction
a) Vérification rapide par PCR
Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné
(contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur luimême (2) => il faut distinguer ces deux populations
(1)
(2)
PCR avec les amorces ayant servi à
l'obtention de l'insert, observation des
produits formés sur gel d'agarose :
Résultats du gel d’agarose :
Aucun produit détecté pour le vecteur seul (2),
mais un produit visible pour le plasmide
recombiné (1)
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6 ) Vérification de la construction
b) Vérification rapide par restriction
Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans
l'insert et un seul site dans le vecteur :
1
2
(ex : MscI)
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6 ) Vérification de la construction
b) Vérification rapide par restriction
1) Digestion enzymatique par une
enzyme avec un site présent dans
l'insert et un seul site dans le
vecteur puis
2) Analyse des produits de restriction
sur gel d'agarose
(1)
(2)
On obtient des cartes de restriction différentes :
une seule coupure et donc une seule bande pour le
vecteur seul (2), deux coupures et donc deux bandes
pour le plasmide recombiné (1)
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6 ) Vérification de la construction
c) Vérification par séquençage : Principe de
la méthode de Sanger
ADN de
séquence
connue
Choix d'une
amorce
ADN de
séquence
inconnue, à
séquencer
Désoxyribose :
formation
possible d'une
liaison
phosphoester
(élongation de la
chaîne
synthétisée)
5’-P-polynucléotide
Synthèse du brin
complémentaire par
une ADN polymérase
La synthèse du brin complémentaire est
faite en présence de nucléotides
désoxyribose,
P
nucléotide
5’-P-polynucléotide
Et de nucléotides didésoxyribose.
Didésoxyribose : formation d'une liaison
phosphoester impossible, blocage de
l'élongation de la chaîne synthétisée
nucléotide
P
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6 ) Vérification de la construction
c) Vérification par séquençage : Principe de
la méthode de Sanger
• Réaction de synthèse du brin complémentaire de l'ADN à
séquencer à partir d'une amorce, et en présence de nucléotides et
d'un didésoxynucléotide => formation de fragments de différentes
tailles, dont la synthèse est bloquée au niveau du
didésoxynucléotide intégré :
ADN à séquencer
A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A
3'
5'
amorce
5'
Brins formés en
présence de
didésoxythymine (ddT)
dans le milieu
réactionnel
5'
5'
5'
5'
5'
ddT
T-A-ddT
T-A-T-C-G-ddT
T-A-T-C-G-T-A-A-ddT
T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT
T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT
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6 ) Vérification de la construction
c) Vérification par séquençage : Principe de
la méthode de Sanger
• Les didésoxynucléotides sont marqués : radioactivité ou
fluorescence.
• Analyse des différents brins formés sur gel ultra-résolutif
(détection d'une différence d'un nucléotide)
5'
5'
5'
5'
5'
5'
ddT
1
T-A-ddT
2
T-A-T-C-G-ddT
3
T-A-T-C-G-T-A-A-ddT
4
T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT 5
T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 6
6
5
4
3
2
1
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6 ) Vérification de la construction
c) Vérification par séquençage : Principe de
la méthode de Sanger
ADN à séquencer :
A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A
3'
5'
Lecture du brin complémentaire :
T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-T
Une réaction de synthèse
différente pour chacun des
didésoxynucléotides, analyse
sur gel pour chaque réaction,
lecture du brin
complémentaire (en partant des
ddT
ddA
ddG
3
1
ddC
4
2
plus petits fragments vers les plus gros)
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6 ) Vérification de la construction
c) Vérification par séquençage : Automatisation du
séquençage
ADN à séquencer :
3'C-A-G-A-A-T-T-G-C-A-G-A-G-T
Lecture du brin complémentaire :
5'G-T-C-T-T-A-A-C-G-T-C-T-C-A
Automatisation des résultats de séquençage : les
didésoxynucléotides sont marqués avec des
fluorescences différentes, cela permet de faire une
seule réaction et une seule lecture. Le séquenceur
détecte la fluorescence et repère la taille des fragments
d'ADN.
On obtient des courbes de fluorescences qui
sont interprétées en terme de nucléotides avec
un indice de confiance (ici barre verte :
confiance maximum)
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