Transcript La Génomique

Biologie Moléculaire
Travailler avec l’ADN
Sujets
 ADN
Genomique vs. Vecteur
 Purification d’ADN plasmidique
 Enzyme de restriction
 Essentielle de la cartographie de
restriction
ADN
 Genomique
 Prokaryote
vs. eukaryote
 Circulaire ou linéaire
 Un ou plus d’un chromosomes
 Extra-genomique
 Vecteurs
 Plasmides
Vecteurs Vs Plasmides
 Vecteur:
 Véhicule
d’ADN permettant le clonage,
maintien et amplification d’une séquence
d’ADN
 Plasmides
 Virus
 Chromosomes
 Tous
les plasmides sont des vecteurs
 Pas tous les vecteurs sont des plasmides
Plasmides
 Petites
molécules d’ADN circulaires
maintenues et amplifiées chez des
cellules eucaryotes ou procaryotes
 Amplification chez les bactéries
 Utilisé
en tant que vecteur pour le
clonage ou l’expression d’ADN d’intérêt
Caractéristiques des Vecteurs
Plasmidiques
Sites de restrictions
uniques pour le clonage
 Origine de réplication
(Ori)
 Marqueur de sélection


Gènes de résistance aux
antibiotiques
Isolation d’ADN
 Buts
 Isolation
de l’ADN désiré
 Chromosomique
 Retirer
ou plasmidique?
les autres composantes
 ADN
chromosomique ou plasmidique?
 Protéines
 ARN
 Produits chimiques
Sels, détergents, etc.
Isolation d’ADN

Lyse cellulaire

Paroi et membrane




Enzymatique
Chimique
Mécanique
Isolation de l’ADN désiré



(suite)
Sédimentation différentielle
Chromatographie
Retirer les autres composantes



Enzymatique
Sédimentation différentielle
Chromatographie
Isolation d’ADN Plasmidique
par Lyse Alcaline (E.coli )
Solutions Utilisées
 Sol.
I – Tampon de suspension
 Tris
HCl - Tampon, protège les acides
nucléiques
 EDTA - Chélates Mg++, empêche les
nucléases de fonctionner
 Sol.
II – Solution de lyse
 NaOH
- ^pH lyse cellulaire, dénature ADN
 SDS - dissous membranes, denture et lie
protéines
Solutions Utilisées
 Sol.
(suite)
III- Acétate de potassium
 Renaturation
de l’ADN
 Précipite
SDS
 Précipite ADN génomique et protéines
 Isopropanol
/ Éthanol
 Précipite
acides nucléiques (plasmide et ?)
 Sels demeurent solubles
 TE-RNase
- Tris & EDTA encore; RNase??
Quantification de l’DNA

Déterminer la Conc. d’DNA


Déterminer la quantité d’DNA



A260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µL
1mL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg DNA
1µL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng DNA
Ne pas oublier de prendre en considération le
FACTEUR DE DILUTION
Enzymes de Restriction
 Clive
les liens phosphodiester internes
 Reconnaissent des séquences doubles
brins spécifiques
 Différentes endonucléases
reconnaissent différentes séquences
 Reconnaissent des séquences
palindromes
Palindromes
 La
même séquence est lue dans la
direction 5’» 3’ sur les deux brins
5’-G G A T C C-3’
3’-C C T A G G-5’
 Les
mêmes liens phosphodiesters sont
clivés sur les deux brins!
5’-G G A T C C-3’
3’-C C T A G G-5’
Différentes Extrémités sont
Générées
5’-G G A T C C-3’
Extrémités franches
3’-C C T A G G-5’
Différentes Extrémités sont
Générées
5’-G G A T C C-3’
Extrémités 5’ protubérantes
3’-C C T A G G-5’
Différentes Extrémités sont
Générées
5’-G G A T C C-3’
Extrémités 3’ protubérantes
3’-C C T A G G-5’
Compatibilité des Extrémités
Extrémités franches
P
OH
HO
P
OP
PO
Compatible
Compatibilité des Extrémités
Extrémités Protubérantes
P
OH
HO
P
OP
P
HO
Incompatible
Compatibilité des Extrémités
Extrémités Protubérantes
P
OH
HO
P
OP
P
HO
Incompatible
Compatibilité des Extrémités
Extrémités Protubérantes
GATC-P
OH
HO
P-CTAG
Appariement
GATC-P O
O P-CTAG
Compatible
Compatibilité des Extrémités
Extrémités protubérantes
GATC-P
HO
P-TCCA
OH
Appariement
GATC-P
OH
HO
P-TCCA
Incompatible
Cartographie des Sites de
Restrictions
L’ADN est-il digéré?
ND
D1
D2
Doit comparer à un
témoin non digéré
La digestion est-elle complète?
Doit comparer à un
témoin non-digéré
ND
D1
D2
Partiel
Complet
Digestion partielle
 Toutes
les molécules cibles ne sont pas
coupées à toutes les sites possibles!
 Génère
différents produits intermédiaires
Digestion partielle
1
2
1
Produit d’une digestion complète
1+2
3
Produit d’une digestion partielle (intermédiaire)
2+3
Produit d’une digestion partielle (intermédiaire)
Complète Vs Partielle
 Une
digestion complète donne une
stoechiométrie de 1:1:1…
 Le
nombre de molécules de chacun des
différents fragments est le même!
 La
stoechiométrie d’une digestion
partielle est variable:
 Ex.
1:3:2…
Ex.
1
2
3
Combien de molécules de chacun des fragments
seraient générées suite à une digestion complète?
3; donc une stœchiométrie de 3:3:3 =1:1:1
Combien de molécules de chacun des fragments
seraient générées suite à une digestion partielle?
Évaluer la Stœchiométrie sur
Gel d’Agarose
 Principe
 La
quantité de bromure d’éthidium qui lie
l’ADN est proportionnelle à la taille de l’ADN
 La quantité de bromure d’éthidium qui lie
l’ADN est proportionnelle à la quantité d’ADN
 Dans
le cas d’une digestion complète, la quantité
de bromure d’éthidium qui lie l’ADN est seulement
proportionnelle à la taille de l’ADN
Pourquoi?
Ex.
D1
D2
Stœchiométrie
pas respectée
Stœchiométrie
pas respectée
Stœchiométrie
respectée
Stœchiométrie
respectée
Exemples
Exemples
ière
1
étape:
Déterminer le nombre de coupures
 Est-ce
que l’ADN a été digéré?
 Non-
Aucune cartographie requise
 Oui
 La
digestion est-elle complète?
 La digestion est-elle partielle?
Quels produits sont des intermédiaires
 Combien
 Les
de fois l’ADN a-t-il coupé
coupures sont dans le vecteur
Aucune cartographie requise
Les coupures sont dans l’insertion
 Cartographie requise
Combien de Sites de Restriction
est-ce qu’il y a?
 ADN
linéaire (ex. Chromosome humain)
 Le
nombre de coupures est égal au
nombre de fragments moins un
 ADN
 Le
circulaire (ex. Plasmide)
nombre de coupures est égal au
nombre de fragments
Les coupures sont-elles dans
l’insertion ou le vecteur?
M
E
B
?
ND
V
B
P
B
insert
P
Taille du vecteur
2.5kpb
S
B coupe 2 fois dans le vecteur et 0 fois dans l’insertion
E coupe 1 fois dans le vecteur et 1 fois dans l’insertion
P coupe 1 fois dans le vecteur et 2 fois dans l’insertion
E
e
2
Étape: Quelles sont les
positions des sites de restrictions?
 Cartographie
relative est faite
 Les sites de restriction sont cartographiés
en relation en un point de référence
 La position du point de référence doit être
connue
Dois Déterminer la Taille de
l’Insertion
M
E
B
?
ND
V
B
P
B
insert
P
Taille du vecteur
2.5kpb
S
1.
2.
3.
Déterminer la taille des fragments issus d’une digestion complète
Déterminer la taille totale du plasmide (Somme des tailles)
Déterminer la taille de l’insertion (Taille du plasmide - Taille du vecteur)
E
Déterminer les Tailles
Ec
P
E
Enz
P
E
Distance (cm)
Tailles
pb
0.6
0.9
2.1
0.3
1.9
3000
1100
900
4500
1000
Donc : Taille du plasmide 5Kpb
Taille de l’insertion 5000pb – 2500pb = 2500pb
Cartographie du Site P
1.1kbp ou
P
P
Insertion (2.5kpb)
1.1kbp
P
Impossible puisque le second
site doit être dans l’insert!
0.9kbp ou 0.9kbp
P
P
P
Insertion (2.5kpb)
Impossible puisque le second
site doit être dans l’insert!
Cartographie du Site P
0.9kbp
1.1kbp
P
P
Insertion (2.5kpb)
P
Ou
1.1kbp
P
P
Insert (2.5kpb)
0.9kbp
P
(Suite)
Déterminer l’Orientation
E
1.0kbp
E
Insertion (2.5kpb)
P
Déterminer l’Orientation
0.9kbp
E
P
P
Insertion (2.5kpb)
1.0kbp
E
Or
1.1kbp
E
1.1kbp
P
P
Insert (2.5kpb)
1.0kbp
E
0.9kbp
P
P
Déterminer l’Orientation
Ec ND
P
E
P+E
P+E