Transcript Le chromosome bactérien ADN double brin

GENETIQUE BACTERIENNE
Dr Christian CARRIERE
Laboratoire de bactériologie
Hôpital Arnaud de Villeneuve
A - Le chromosome bactérien
ADN double brin
« Gènes de la vie »
•Protéines
structurales
•Protéines
enzymatiques
Le chromosome bactérien
Le chromosome bactérien
Applications pratiques
1 - Epidémiologie moléculaire
?
!
“épidémiologie
conventionnelle”
“épidémiologie
moléculaire”
Principe de l’épidémiologie moléculaire
But : Comparer des isolats
bactériens entre eux

Même espèce bactérienne


Coupure par 1
endonucléase
Migration électrophorétique
Profils de restriction
Comparaison des profils
= Technique
d’électrophorèse en champ
pulsé (ECP)
Variations observées
sur les profils d’ECP
Profil de
référence
A
Gain (B) et perte (C)
d’un site de restriction
sur le fragment de 400 kpb
Insertion (D) et perte (E)
d’un fragment d’ADN sur
le fragment de 400 kpb
B
C
D
E
3
3
2
2
500 kpb
400 kpb
200 kpb
50 kpb
Nombre de différences par
rapport au profil de référence
Interprétation de profils d’ECP
Nombre de
modifications
génétiques par
rapport à la souche
épidémique
Nombre de
fragments
différenciant la
souche testée de la
souche épidémique
Interprétation
microbiologique
des profils
Interprétation
épidémiologique
Semblables
Souche faisant partie
de l’épidémie
0
0
1
2–3
Très proches
Souche faisant
probablement partie
de l’épidémie
2
4–6
Proches
Souche faisant
possiblement partie
de l’épidémie
3
> ou = 7
Différents
Souche non reliée à
l’épidémie
M
kb
436,5
194
48,5
1
2
3
4
5
6
Epidémiologie moléculaire
Isolats de Pseudomonas aeruginosa
- 1 à 7 : 7 patients différents
- 8 et 9 : fibroscope
M
kb
436,5
194
48,5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Isolats de Staphylocoques
- service N° 1 (1 à 5) et
- service N° 2 (6 à 9)
Le chromosome bactérien
Applications pratiques
2 - Identification : genre et espèce (taxonomie)
ex : Escherichia coli

Ancienne

dénaturation ou
fusion de l’ADN

Tm : température de
fusion

G-C%

Notion d’espèce
- DTm et G-C % proches
Taxonomie bactérienne
moderne
=> Espèces rares ou difficiles à identifier par méthodes commercialisées
Culture
banques de
séquences
d ’ADN
PCR
ADN r16S,
Séquençage
Comparaison
de séquences
Nom de
l ’espèce
Analyse d’une séquence sur Internet
1-Aller sur
un site
spécifique
2- Copier
la séquence
à analyser
3- Envoyer
la recherche
Identification d’une bactérie après séquençage
Alignement
des 2 séquences
Pourcentage d’identité
entre la séquence
analysée et la séquence
la plus proche de
la banque de données
Si le pourcentage est > à 97 % = même genre et espèce
Si le pourcentage est < à 97 % = nouvelle espèce ou nouveau genre
Les plasmides





Fragments d’ADN double brin
Circulaires
Intra cytoplasmiques
Auto réplicatifs
Portent des gènes de « survie »

Adaptation à l’environnement

Résistance aux antibiotiques +++
B – Les variations génotypiques


Ce sont des modifications du génome
bactérien essentiellement dues à des
mutations
Pour le clinicien, les applications :

Virulence

Résistance acquise aux antibiotiques
Les variations génotypiques
Que se passe t-il au niveau génomique ?

Microinsertions et microdélétions



Mutations ponctuelles


Mutations faux sens : erreur
Mutations non sens : codon stop
Idem ci-dessus
Macroinsertions et macrodélétions


Séquence de type IS (séquences d’insertion)
Transposons
 Gain ou perte de gènes entiers (Résistance ATB)
La résistance a un support moléculaire
(exemple des antituberculeux)
Gènes mutés dans la résistance aux anti-tuberculeux (connus…)
ISONIAZIDE
katG, inhA, kasA, aphC
RIFAMPICINE
rpoB
PYRAZINAMIDE
pncA
ETHAMBUTOL
embCAB
STREPTOMYCINE
rpsL, rrs
Exemple : Mécanisme de résistance
à la rifampicine
 Mode d’action :
 La rifampicine se fixe à la sous-unité  de l’ARN polymérase
 Empêche l'initiation de la transcription
 perturbe la synthèse des ARN messagers
 Mécanisme de résistance :
 95% des souches portent des mutations ponctuelles dans le
gène rpoB entre les codons 511 et 533
 Diminution de l'affinité de l'ARN polymérase pour la
rifampicine
Mutations dans le gène rpoB
511 533
rpoB
511 513
516
Leu
Gln
Asp
Pro
Leu
Pro
Tyr
Val
522
526
531
533
Ser
His
Ser
Leu
Leu
Tyr
Asp
Leu
Arg
Leu
Trp
Pro
Propriétés des variations
génotypiques

1 - Spontanéité

le mutant résistant préexiste à l’utilisation
de l’antibiotique qui le sélectionne
ATB
Bactéries sensibles
Bactéries résistantes
à l’antibiotique
Population bactérienne
ATB
Population bactérienne
devenue résistante
Propriétés des variations
génotypiques




2 - Rareté
Taux de mutation = probabilité d’avoir un mutant
résistant dans une population bactérienne ex : 10-5
Probabilité d’avoir 2 mutants résistants à 2 ATB =
produit des probabilités de chaque mutation
Application : Caverne pulmonaire=108 bacilles
-7
 Rifampicine : Tx mut. = 10
-5
 Isoniazide : Tx mut. = 10
 Mutant isoniazide et rifampicine « spontané »
= 10-7 x 10-5 = 10-12
Propriétés des variations
génotypiques

3 - Stabilité


transmissible à la descendance
4 - Inductibilité

U.V., mutagènes…
SUPPORT GENETIQUE DE
LA RÉSISTANCE
 Résistance naturelle : chromosomique
 Résistance acquise :
- chromosomiques, secondaires à une mutation
- extra-chromosomiques par acquisition de gènes
ex : plasmides
C - Transferts de matériel
génétique



Transformation
Conjugaison
Transduction
Caractéristiques communes à tous
ces mécanismes de transfert
Ces transferts d’ADN doivent être
suivis de recombinaison génétique
I – La Transformation


Transfert d’un fragment d’ADN en
solution d’une bactérie donatrice à
une bactérie réceptrice
Ce modèle avait permis de
démontrer que l’ADN était le support
de l’hérédité en 1944

Expériences de Griffith
La transformation
Exemple : transformation des pneumocoques par
de l’ADN provenant de Streptocoques ORL

Les Streptocoques ORL




Sont des commensaux de la gorge, salive…
Peuvent porter des gènes de résistance aux
antibiotiques
Sont sélectionnés par l’antibiothérapie
Transforment les Pneumocoques
= DANGEREUX car les Pneumocoques
deviennent à leur tour résistants
II – Conjugaison
Processus sexuel strict
 Contact et appariement
 Sexes différents, pili sexuels
 Pont cytoplasmique
 Transfert d’ADN chromosomique
à sens unique, en général partiel

La conjugaison
La conjugaison : schéma
La conjugaison bactérienne




Intéresse surtout les bactéries à
Gram négatif
N’importe quel gène peut être
transféré : résistance, virulence …
Principal facteur d’évolution
bactérienne
Intéresse aussi l’ADN plasmidique
(plasmides conjugatifs)
Transfert de plasmides de
résistance par conjugaison
III - La transduction


Transfert de fragments d’ADN bactérien
par l’intermédiaire de vecteurs :
bactériophages ou « phages »
Les bactériophages sont des virus
infectant de façon spécifique les
bactéries



Se répliquent dans la bactérie
Utilisent la « machinerie cellulaire »
Peuvent lyser la bactérie
La transduction
soit conversion lysogénique
Expression du gène = prophage
Soit cycle lytique
Réplication du phage
Exemples de conversion
lysogénique

Production de toxines = virulence

Corynebacterium diphteriae


Toxine diphtérique : diphtérie
Streptococcus pyogenes (groupe A)

Toxine érythrogène : scarlatine
RESISTANCE BACTERIENNE
NATURELLE
ACQUISE
Qq souches d’une espèce
Tend à se répandre
Chromosomique
Fixe
Constante
1 espèce bactérienne
1 ATB ou 1 famille
Transm. Verticale
Mutations
Chromosomique
Rare
Stable
Spontanée
1 ATB ou 1 famille
Transm. Verticale
Extra-Chromosomique
Éléments Génétiques
Mobiles (Plasm., Tn.)
Fréquent
Contagieux
Plusieurs ATB = MultiR
Transm. Horizontale