Transcript Testing moléculaire RER/MSI

Atelier Instabilité Microsatellitaire
26 avril 2014, Bordeaux
Testing moléculaire RER/MSI
Isabelle Soubeyran
Unité de Pathologie Moléculaire Institut Bergonié – Bordeaux PGMC d’Aquitaine
Système RER = système de réparation de l’ADN
INSTABILITE MICROSATELLITAIRE
Erreurs de réplication
Complexes protéiques
dimériques
•MLH1/PMS2,
MLH1/PMS1
•MSH2/MSH6,
Protéine
déficiente
MSH2/MSH3
Reconnaissance
des erreurs
Réparation
ADN
Poulogiannis, Histopathology 2010
Défaut
réparation
ADN
INSTABILITE MICROSATELLITAIRE
Défaut réparation = conséquences sur l’ADN
Electrophorèse capillaire :
fragments d’ADN additionnels
EN PRATIQUE
INSTABILITE MICROSATELLITAIRE
Tumeur
Immunohistochimie
Recherche perte expression des
protéines RER dans tumeur
Etude de l’instabilité
microsatellitaire
Analyse en biologie moléculaire à
partir des ADN extraits de la tumeur
INSTABILITE MICROSATELLITAIRE
TEST RER/instabilité microsatellitaire
Microsatellites = petites séquences répétées d’ADN de 1 à 6 bases dispersées tout au long du génome sensibles aux erreurs de réplication mais peu polymorphes
Panel de 5 régions ciblées par le test : Bat25, Bat26, NR21, NR24, NR27 (Bethesda modifié) : colon+++
Reflète l’état de stabilité de l’ADN
NR27
BAT26
NR21
BAT25
NR24
1- PCR pentaplex polyA fluorescente
2 – migration et analyse de fragments
Principes de la PCR
PCR = Amplification exponentielle et spécifique d’un
fragment d’ADN dont la séquence est connue
ADN tumoral
extrait du bloc
dNTP
amorces
enzyme
Chauffage 95°C, 1mn
50-65°C, 1mn
72°C, 1-2mn
1 PCR pour chaque région d’ADN ciblée
Amorce : séquence nucléotidique complémentaire d’une séquence connue du gène étudié
Elongation : synthèse d’ADN complémentaire par incorporation de nucléotides grâce à une enzyme
l’ADN polymérase
INSTABILITE MICROSATELLITAIRE
Migration sur séquenceur et analyse de fragments
Interprétation :
– Profil normal : profil pMMR, MSS ou RER‐négatif
INSTABILITE MICROSATELLITAIRE
Pics additionnels (flèches rouges) – ≥ 2 marqueurs instables : profil dMMR, MSI‐High ou phénotype RER positif
ADN tumeur
INSTABILITE MICROSATELLITAIRE
1 marqueur instable
ADN tissu sain
Profils ADN tumeur et tissu sain
superposable
=
polymorphisme de Bat25
=
Profil MSS/pMMR/RER négatif
ADN tissu sain
Profils ADN tumeur et tissu sain
différents
=
1 marqueur instable
=
Profil MSI low/pMMR/RER négatif
INSTABILITE MICROSATELLITAIRE
Etiologie tumeurs RER +/MSI :
2 mécanismes différents Mécanismes
Mutation gène
MMR
Méthylation
promoteur MLH1
Conséquences
Instabilité
Anomalies
secondaires
Mutation gène
MMR
Méthylation
promoteur MLH1
INSTABILITE MICROSATELLITAIRE
Instabilité
2 mécanismes =
• mutation (syndrome de Lynch)
• méthylation promoteur MLH1 (sporadique)
Confrontation IHC
Perte MSH2/MSH6
Perte isolée MSH6 ou PMS2
LYNCH
Consultation oncogénétique
Perte MLH1/PMS2
Phénotype RER+ avec perte MLH1
Poursuite des analyses
Mutation gène
MMR
Méthylation
promoteur MLH1
INSTABILITE MICROSATELLITAIRE
Instabilité
Phénotype RER+ avec perte MLH1
Poursuite des analyses
Autres tests moléculaires utiles :
– Recherche méthylation promoteur MLH1
– Et /ou recherche mutation BRAF (40‐60%)
• Recherche sur ADN tumeur déjà extrait pour MSI
• Techniques de PCR
• Si BRAF et méthylation négatifs : Lynch. – Cs d’oncogénétique avant recherche de mutation à recommander
• Si BRAF et/ou méthylation positifs : cas sporadique probable (15% CCR)
Gestion du prélèvement
1- IHC
2- BM
Forage
Sélection zone T
-
cerclage
-
évaluation %
cellularité T
Lyse cellulaire
élution
ADN
Quantification
ADN
Limites
1- biopsies
si quantité et % faible : privilégier l’IHC
2- les prélèvements faiblement cellulaires
Carcinome colloïde muqueux
Résection rectale
post-radiothérapie
INSTABILITE MICROSATELLITAIRE
Avantages et Inconvénients du test moléculaire
Avantages
• Très spécifique (pas de faux +) • Si associé à perte MLH1, peut et doit être complété par la recherche de mutation de BRAF ou d’hyperméthylation du promoteur de MLH1 pour éliminer une cause sporadique • Permet de rattraper des faux – de l’IHC
Limites
• Ne permet pas à lui seul d’orienter vers étiologie (confrontation IHC et tests complémentaires)
• Moins performant que IHC si quantité et % cellules tumorales dans l’échantillon <20% (risque faux – ) • Moins sensible que l’IHC pour les K non coliques (faux – )