Transcript PPT

Biologie Moléculaire
Travailler avec l’ADN
Sujets
 ADN
Genomique vs. Vecteur
 Purification d’ADN plasmidique
 Enzymes de restriction
 Cartes de restriction
ADN
 Genomique
 Prokaryote
vs. eukaryote
 Circulaire ou linéaire
 Un ou plus d’un chromosomes
 Extra-genomique
 Vecteurs
 Plasmides
Vecteurs Vs Plasmides
 Vecteur:
 Véhicule
d’ADN permettant le clonage, le
maintien et l’amplification d’une séquence
d’ADN
 Plasmides
 Virus
 Chromosomes
 Tous
les plasmides sont des vecteurs
 Pas tous les vecteurs sont des plasmides
Plasmides
 Petites
molécules d’ADN circulaires
maintenues et amplifiées chez des
cellules eucaryotes ou procaryotes
 Amplification chez les bactéries
 Utilisé
en tant que vecteur pour le
clonage ou l’expression d’ADN d’intérêt
Caractéristiques des Vecteurs
Plasmidiques
Sites de restrictions
uniques pour le clonage
 Origine de réplication
(Ori)
 Marqueur de sélection


Gènes de résistance aux
antibiotiques
Isolation d’ADN
 Buts
 Isolation
de l’ADN désiré
 Chromosomique
 Retirer
ou plasmidique?
les autres composantes
 ADN
chromosomique ou plasmidique?
 Protéines
 ARN
 Produits chimiques
Sels, détergents, etc.
Isolation d’ADN

Lyse cellulaire

Paroi et membrane




Enzymatique
Chimique
Mécanique
Isolation de l’ADN désiré



(suite)
Sédimentation différentielle
Chromatographie
Retirer les autres composantes



Enzymatique
Sédimentation différentielle
Chromatographie
Isolation d’ADN Plasmidique
par Lyse Alcaline (E.coli )
Solutions Utilisées
 Sol.
I – Tampon de suspension
 Tris
HCl - Tampon, protège les acides
nucléiques
 EDTA - Chélates Mg++, empêche les
nucléases de fonctionner
 Sol.
II – Solution de lyse
 NaOH
- ^pH lyse cellulaire, dénature ADN
 SDS - dissous membranes, denture et lie
protéines
Solutions Utilisées
 Sol.
(suite)
III- Acétate de potassium
 Renaturation
de l’ADN
 Précipite
SDS
 Précipite ADN génomique et protéines
 Isopropanol
/ Éthanol
 Précipite
acides nucléiques (plasmide et ?)
 Sels demeurent solubles
 TE-RNase
- Tris & EDTA encore; RNase??
Quantification de l’ADN

Déterminer la Conc. d’ADN


Déterminer la quantité d’ADN



A260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µL
1mL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg ADN
1µL d’une solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng ADN
Ne pas oublier de prendre en considération le
FACTEUR DE DILUTION
Enzymes de Restriction
 Clive
les liens phosphodiester internes
 Reconnaissent des séquences doubles
brins spécifiques
 Différentes endonucléases
reconnaissent différentes séquences
 Reconnaissent des séquences
palindromes
Palindromes
 La
même séquence est lue dans la
direction 5’» 3’ sur les deux brins
5’-G G A T C C-3’
3’-C C T A G G-5’
 Les
mêmes liens phosphodiesters sont
clivés sur les deux brins!
5’-G G A T C C-3’
3’-C C T A G G-5’
Différentes Extrémités sont
Générées
5’-G G A T C C-3’
Extrémités franches
3’-C C T A G G-5’
Différentes Extrémités sont
Générées
5’-G G A T C C-3’
Extrémités 5’ protubérantes
3’-C C T A G G-5’
Différentes Extrémités sont
Générées
5’-G G A T C C-3’
Extrémités 3’ protubérantes
3’-C C T A G G-5’
Compatibilité des Extrémités
Extrémités franches
P
OH
HO
P
OP
PO
Compatible
Compatibilité des Extrémités
Extrémités Protubérantes
P
OH
HO
P
OP
P
HO
Incompatible
Compatibilité des Extrémités
Extrémités Protubérantes
GATC-P
OH
HO
P-CTAG
Appariement
GATC-P O
O P-CTAG
Compatible
Compatibilité des Extrémités
Extrémités protubérantes
GATC-P
HO
P-TCCA
OH
Appariement
GATC-P
OH
HO
P-TCCA
Incompatible
Cartes de Restrictions
Cartes de restrictions
 Déterminer
les positions des site des
enzymes de restrictions
 Cartes
d’ADN linéaires
 Cartes d’ADN circulaires (plasmides)
 Cartes d’insertions dans un vecteur
Approche
1.
2.
3.
4.
Déterminer si l’ADN a été digéré
La digestion est elle complète ou
partielle?
Combien de coupures?
Déterminer les positions relatives
1. L’ADN est-il digéré?
1
2
3
4

Comparez au témoin
non digéré

Quelles échantillons
n’ont pas été digérés?


1 et 4
Quelles échantillons
ont été digérés?

2 et 3
2. La digestion est-elle complète?
 Digestion
complète
 Toutes
les molécules d’ADN sont clivées à tous
les sites possibles
 Digestion
 Une
partielle
fraction des molécules non pas été digéré
 Partielle
non digéré
 Une
fraction des molécules a été digéré, mais
pas à tous les sites possibles
 Digestion
partielle
Digestion complète
Digestion
Digestion partielle: partielle non digéré
Non digéré
Digestion
Digestion partielle
Digestion
partielle
partielle
La digestion est-elle complète
ou partielle?
1
2
3
4
Comparez au
témoin
 Vérifiez l’intensité
des bandes
 Vérifiez les tailles

3. Combien de coupures?
 Nombre
de sites
 ADN
circulaire = nombre de bandes
 ADN linéaire = nombre de bandes – 1
4. Déterminer les positions relatives
 La taille des fragments représente la distance
entre les sites
Cartes d’ADN linéaires
Enzyme
Fragments (Kb)
HindIII
3 et 4
SalI
2 et 5
HindIII + SalI
2 et 3
7.0
3.0
HindIII
4.0
3.0
2.0
2.0
HindIII + SalI
Cartes d’ADN circulaires (plasmides)
Enzyme
Fragments (Kb)
BamHI
2, 3 et 5
HindIII
1 et 9
BamHI + HindIII
1, 1.5, 2, 2.5 et 3
7.0
10.0
1.5
10.0
Cartes d’insertions
Site d’insertion
SCM
SCM
Plasmide recombinant
Vecteur
Approche
Déterminer la taille totale
2. Déterminer la taille de l’insertion
1.

Taille totale – taille du vecteur
Déterminer le site d’insertion dans le SCM
4. Déterminer quelles enzymes coupent dans
l’insertion
5. Cartographie en relation aux sites de
positions connues
3.
Cartes d’insertions
1.
Taille totale
•
2.
Taille de l’insertion
•
Enzyme
Fragments
BamHI
7.7Kb
EcoRI
1.0, 3.0, 3.7Kb
PstI
2.0 et 5.7
XbaI
2.7 et 5.0
3.
7.7Kb
7.7 – 2.7 = 5.0Kb
Site d’insertion
•
Génère 2 fragments dont
un est la taille du vecteur
•
XbaI
Cartes d’insertions
Sites a cartographier
Enzyme
Fragments
Coupures
totales
Coupures
vecteur
Coupures
insertion
BamHI
7.7Kb
1
1
0
EcoRI
1.0, 3.0, 3.7Kb
3
1
2
PstI
2.0 et 5.7
2
1
1
XbaI
2.7 et 5.0
2
Site
d’insertion
0
Cartographie de PstI : 2 et 5.7Kb
5.7 Kb
2.0 Kb
5.0
Cartographie de EcoRI: 1, 3 et 3.7Kb
P
3.7
1.0
3.0
1.0
1.0
3.0