Transcript Réparation de coupures double brin (DSB) Non Homologous End

Master 1 : Réparation et maintien de l’intégrité du génome
Réparation de coupures double brin (DSB)
Non Homologous End Joining : NHEJ
Recombinaison Homologue : RH
"
Anne Bresson
UMR7242 Biotechnologie et signalisation cellulaire CNRS-Unistra
Irebs, ESBS 300, Bld Sébastien Brant CS 10413, 67412 Illkirch Tel: 03 68 85 47 03
[email protected]
27/11/2014
irebs.u-strasbg.fr/
DSB
Stabilité du génome
Variabilité du génome
Cassure double de l’ADN et alors ?
Stop
?
D’après Evi Sotoglou’s lab (2012) CP CNRS Conséquences
Causes
DSB
Coupures double brin de l’ADN
Cycle cellulaire
Réparation
NHEJ
HR
Non Homologous
Homologous
End Joining
Recombination
Maladies liées à un défaut dans la réparation des DSBs
Nombre de DSB produites par différentes actions:
Philadelphie -> Paris : 0,05 / cellule
Accident de Tchernobyl : 12 / cellule
Irradiation thérapeutique en faisceau : 80 / cellule
Cassures double brin (DSB)
Rate of production of endogenous DSBs in different species (Vilenchik and Knudson, 2003 PNAS 100: 12871) DSBs
Species
Homo sapiens
bp per genome
Cell cycle
3,2 109
108 bp
50
0.8
~2,6 pour 109 bp
Xenopus laevis
6
Saccharomyces cerevisiae
Escherichia coli
DSB exogènes
109
160
2.7
1.2 107
One per 4-5 cells
~2
4
One per 1-10 cells
≥2
106
-> nombre moyen de dommages dans une cellule humaine soumise à un
rayonnement gamma de 1 Gy :
≥ 2500 dommages de base
400 coupures simple brin (SSB)
1000 coupures double brin (DSB)
~312 pour 109 bp
X 120 Causes des cassures double brin (DSB)
Cassures accidentelles Ø  Radiations ionisantes : (≥ 10 eV) rayonnements X, gamma Ø  Dérivés radicalaires de l oxygène : ion superoxide, H2O2 => Espèces Oxygénées Réactives (ROS) donnent ~ 5000 SSBs/cell/jour dont 1%=> DS Ø  Agents chimiques : cancérogènes, les produits radiomimétiques qui miment les effets des radiations et
qui peuvent être utilisés comme des drogues antitumorales (moutarde azotée, bleomycin, mitomycin C,
neocarzinostatin…)
Ø  Evénements secondaires liés à la réplication : réplication en conditions de stress (altération du pool de
dNTPs..), conversion d une cassure simple-brin (SSB) en DSB…
Cassures programmées
Ø  recombinaison dans les immunoglobulines V(D)J Ø  switch isotypique (class switch recombinaton) CSR Ø  méiose
(Voir le cours de Jérome Wagner)
Goodarzi & Jeggo (2013) Adv in Genet 82 : 1
Conséquences des cassures double brin (DSB)
Cassure!
Conséquences des cassures double brin (DSB)
Arrêt du
cycle
cellulaire
Dommages
ADN
Apoptose
Double Strand Break
DSB
Réparation
DSB
HR: Homologous Repair
NHEJ: Non Homologous
End joining
-> contribuent à l instabilité génomique
-> rôle important dans les traitements des cancers Cancer
Vieillissement
Maladie
congénitale
Forte sensibilité :
Grande flexibilité : detection d’une seule DSB
capacité à réparer une grande variété de d’extrémités
DSBR
Coordination entre la réparation Réparation la plus fidèle possible
et l’état physiologique de la cellule
(évite des dommages collatéraux!)
Visualisation d’une DSB
DSB et foyers de réparation IRIF (irradiation induced foci) Accumulation
Cinétique de recrutement de quelques protéines
Temps
Réponse cellulaire / DSB
Origines des DSB
Cycle cellulaire
Recombinaison
Homologue
(RH/HR)
DSB
MRN
Ligature
53BP1
d’extrémités
non homologues
“Non Homologous
End joining”
(NHEJ)
From Hoejjmakers (2001) Nature 411: 366
NHEJ
Mécanisme de réparation des DSB
-> erreurs, perte ou gain de nucléotides
mais
indispensable pour la diversification immunitaire -> recombinaison V(D)J
-> class switch recombination (CSR)
RH
Mécanisme de réparation des DSB précis et fidèle
mais
requiert la présence d’une chromatide soeur
Importance des 2 DSBR
Cellules eucaryotes : levures Cellules eucaryotes : HeLa HR ≥ NHEJ
HR < NHEJ
≠ ?
Génome humain répétitif (40%)
-> RH mécanisme assez lent pour réparer les DSB -> translocations chromosomiques dans ces régions répétées
Cascade d événements moléculaires en réponse à une DSB
Bekker & Mailand (2010) DNA Repair 3 : 1219
La reconnaissance d’une DSB est déclenchée par une altération de la structure de la chromatine
=> 2 extémités de DSB protégées
Thompson (2012) Mut Res 751 : 158
Réponse cellulaire et moléculaire / DSB
γH2AX
γH2AX
DSB
MRN
MDC1
Détecteurs de DSB
53BP1
H2AX
γH2AX se fixe sur les DSB
(marqueur de DSB in vivo)
facteurs qui vont
enclencher l arrêt
du cycle cellulaire
L’un des points clef de la réparation
de l’ADN est la ~P de l’histone H2AX
sur la Ser139 => γH2AX
Cours de Jean-Christophe Amé
Une DSB va induire une cascade d événements cellulaires qui vont :
Ø  Arrêter le cycle cellulaire (cours d A. Cordonnier et de J.C. Amé)
Ø  Recruter les facteurs de réparation
DSB
Cycle cellulaire ?
Balance des 2 DSBR / phase du cycle cellulaire
G2
M
HR
G1
NHEJ
majoritaire
S
Phases du cycle cellulaire et
DSBR au cours des ces phases
Rothkamm et al (2003) MCB 23: 5706
NHEJ
RH
Non Homologous End joining
Recombination Homologue
Formation de foyers γH2AX (anti γH2AX), marqueur de DSBs
après dommages sur différentes cellules
Celllules Sanguines
30 min
1Gy IR
(radiations
ionisantes)
=> DSBs
Celllules de colon (d): normales (e): adenocarcinome => DSB
From Bonner et al (2008) Nature Reviews Cancer 8: 957 Cinétique de recrutement de protéines de SSBR et DSBR sur trait de laser (lésions SSB et DSB)
Temps après irradiation (min)
PARP-1
XRCC1-1
SSBR
ATR
Ku, DNA-PK, XLF
MRN, MDC1
53BP1, BRCA1
DSBR
RNF68
From Polo et al (2011) Genes & Dev 25 : 409
DSB
γH2AX
Recombinaison
Homologue
(RH)
Non Homologous
End joining
(NHEJ)
@
ADN avec DSB
Etapes du NHEJ
Nettoyage :
élimination des extrémités
5 débordantes et
résection des extrémités
3 trop longues
Ligation :
Synapse :
reconnaissance des
extrémités d une DSB
et maintien à proximité
les unes des autres
après synthèse
d ADN si nécessaire
ADN intact
Meek et al (2004) Immun Rev 200: 132
@
Synapse : reconnaissance des extrémités d une DSB et maintien
à proximité les unes des autres
Fixation sur les 2 extrémités des DSBs
du dimer Ku70/Ku 80
et de DNA-PK (protéine kinase)
Reconnaissance des extrémités d une DSB et maintien à proximité l une de l autre
Heterodimère Ku : Ku70 + Ku80 -> ~4 105 mol/cellule, structure en anneau
-> très forte affinité pour les extémités d’ADN ~2 109 M-1
Ku70/80 = anneau asymétrique
Hélice d AND dans un tunnel formé
par hétérodimère Ku
ü  hétérodimère Ku est très stable
ü  souris - Ku 70
Ku 80
Downs & Jackson (2004) Nature Reviews Mol. Cell Biol. 5 : 367
cellules de hamster - Ku 80
Ku 70
Ku70/80 se lie aux extrémités des DSB
Ku est impliqué dans ≠ processus cellulaires
Ø  indépendamment de la séquence
Ø  migre sur l ADN sans requérir d’ATP
Downs & Jackson (2004) Nature Reviews Mol. Cell Biol. 5 : 367
Fonctions de Ku dans le NHEJ ?
Ø  Maintien des extrémités d ADN (DSB) à proximité l une de l autre
Ø  Protection des DSBs contre les attaques des exonucléases
Ø  Plateforme de recrutement d autres protéines:
DNA-PKcs, DNA-ligase-IV-XRCC4, WRN1, MRN, PARP1
Recrutement de DNA-PKcs par Ku
DNA-PKcs DNA-dependent protein kinase ~469 kDa (PI3K-related kinase)
(n existe pas dans certains organismes eukaryotes Drosophila melanogaster,
Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae)
Ku70/ C-ter 80
DNA-PKcs
protection des extrémités d ADN
DNA-PKcs autophosphorylation
Accessibilité des DSBs à d autres protéines
Rôle de l’autophosphorylation de DNA-PKcs
dans le contrôle de l accessibilité à la DSB
par d autres facteurs de réparation
1.  Pas de phosphorylation -> extrémités
DSB vérouillées
A
P
2.  Auto~P de DNA-PKcs sur le site A ->
ouverture du site et alignement des 2
extrémités de l ADN
3.  Auto~P de DNA-PKcs sur le site P ->
blocage des DSB et stimulation de
l interaction avec le complexe XLF/
XRCC4/ADN-ligaseIV
4.  Déphosphorylation totale -> recyclage de
4
DNA-PKcs et Ku
Neal & Meek K. 2011 Mutat. Res. 711 : 73
Nettoyage des extrémités débordantes
5 !
3 !
ATGC!
Complexe DNA-PKcs-Artemis~P
-> endonucléase sur les extrémités
sur 3 et 5 débordantes
5 !
3 !
Synthèse d ADN par
ADN Pol µ ou ADN Pol λ 5 !
3 !
ATGC!
G!
Processing des extrémités des DSB
Ø  Recrutement du complexe de ligation XRCC4-DNA ligase IV-XLF
5 !
3 !
5 !
3 !
ATGC!
TACG!
ATGC!
TACG!
Ligation des extrémités
d ADN par le complexe
ADN ligase IV/XRCC4
5 !
3 !
ATGC!
TACG!
Etapes du NHEJ
Nettoyage :
ADN avec DSB
DNA-PKcs-Artemis
Ligation :
Synapse :
Ku70/80
DNA-PKcs
XRCC4-Lig4 XLF
ADN intact
NHEJ
Mécanisme de réparation des DSB, non précis,
-> perte ou gain de nucléotides
MAIS
indispensable pour la diversification immunitaire
des domaines variables des immunoglobulines V(D)J
et le class switch recombination CSR !!!
Recombinaison V(D)J : Variable(Diversity)joining
Ø  Processus qui a lieu dans les cellules B et T en développement
Ø  Gènes codant pour les Ig sont présents mais non actifs
Ø  Loci -> combinés pour donner les formes matures Ig
Ø  Diversité des Ig -> association des différents fragments V, D et J
-> donne 1.9 10
V(D)J joined"
rearranged DNA"
6
combinaisons d anticorps H/L
Recombinaison V(D)J est un processus en deux étapes qui :
Ø  génére une DSB
Ø  répare cette DSB par NHEJ
Ku70/80
DNA-PKcs
Artemis
DSB
XRCC4-LigIV
Protéines Rag sont des
Intervention des protéines de NHEJ:
endonucléases-recombinases
Ku70/80, DNA-PK, Artemis,
XRCC4-LigIV
Rooney et al (2004) Immuno Rev 3: 115
=> Diversité de sites antigéniques
=> Différence d’isotype des anticorps
DSB et NHEJ : mécanisme et protéines requises
(Snapshot, Cell 142 2010)
DSB
DSB et NHEJ : mécanisme et protéines requises
(Snapshot, Cell 142 2010)
C-NHEJ = classical or canonical NHEJ
DSB et NHEJ : mécanisme et protéines requises
(Snapshot, Cell 142 2010)
Alternative : A-NHEJ
-> indépendant de Ku (observé dans les cellules déficientes en Ku)
A-NHEJ : -> moins fidèle
-> PARP-1, MRE11, CtIP, PNK, Ligase III, I ?
Deriano & Roth (2013) Annu Rev Genet 47 / 451 Protéines récemment impliquées dans le NHEJ
!
XRCC1 : role dans le SSBR et le BER
(Cours de Valérie Schreiber)
APE1
g-Rays
5'
P OH
5'
5'
• Base damage
recognition
XRCC1
P OH
5'
• SSB recognition
P OH
• XRCC1 co-ordinates SSB repair as a scaffold
protein that sequentially interacts with and
stimulates the various enzymes of the BER / SSBR
pathways.
PARP-1
XRCC1 Lig3
OH P
• XRCC1 recruitment scaffold assembly
PNK
XRCC1Lig3
• XRCC-1 accumulation at SSBs is PAR synthesis
dependent:
FEN1
PNK
• End processing
PARP-1
Polß PARP-2
XRCC1Lig3
Lig3
anti-XRCC1 Dapi + merge • Gap filling
PARP-1
Polß
anti-PAR
PARP-2
• DNA ligation
XRCC1
Adapted from Whitehouse et al. (2001) Cell 104, 107-117
Protéines récemment impliquées dans le NHEJ
XRCC1 : protéine-plateforme qui recrute d’autres protéines NLS!
BRCT1!
1"
159"
314"
402"
BRCT2!
538"
633"
XRCC1!
S371!~P
DNA-PK phosphorylation
of XRCC1
~P
XRCC1!
XRCC1
~P
XRCC1<->DNA-PK DNA-PK => P~XRCC1
P~XRCC1 => dissociation du dimère XRCC1 en monomère
Lévy at al (2006) NAR 34: 32-41
Protéines récemment impliquées dans le NHEJ
=> XRCC1 : connexion entre SSBR et NHEJ
Foyers γH2AX => marqueurs de DSB
Foyers gH2AX
Sans XRCC1 : DSB mal réparés
Marqueur de DSB
XRCC1~P :
DSB bien réparés
XRCC1 non ~P : DSB mal réparés XRCC1~P
XRCC1 non ~P
XRCC1 monomère
XRCC1-/-
Foyers γH2AX
/cell Non
réparation
des DSB
+ XRCC1~P
+ XRCC1 non ~P XRCC1 dimère
Rejoining
of DSB
SSBR
Levy et al (2006) NAR 34: 32 Protéines récemment impliquées dans le NHEJ
MRE11
Activité nucléase de MRE11 augmente A-NHEJ : les délétions ≥ 4 nt de 19 % à 61 % C-NHEJ
A-NHEJ
C-NHEJ
A-NHEJ
Activité nucléase de MRE11 dans les
2 voies de NHEJ Rass et al (2009) Nature Struct & Mol Biol 16:819
Protéines récemment impliquées dans le NHEJ
PARP-3 : 3ème membre de la famille PARP, impliqué dans la réparation des DSB et dans le contrôle du cycle cellulaire => acteur clé de l’intégrité du génome
=> Role de PARP-3 dans le NHEJ
Rouleau et al, 2007 J Cell Biol 100 : 385-401; Boehler et al., 2011 PNAS 108 : 2783-2788; Rulten et al, 2011 Mol Cell 41 :33-45
DSBS Repair and PARPs
Beck et al, 2014 Exp Cell Res 329 :18-25
Protéines récemment impliquées dans le NHEJ
APLF : “Aprataxin and FNA-PK like factor” -> activité de liaison d’autres protéines du NHEJ
-> se lie aux histones poly(ADP-ribosyl)ées par PARP-3
-> augmente l’activité de ligation
PAR
Rulten et al, (2011) Mol Cell 41 : 33 & Grundy et al. (2012) EMBO J 32 : 112
PAR
C-NHEJ
versus
A-NHEJ
End resection
Dueva & Iliakis, (2013) Transl Cancer Res 2 : 163
NHEJ
V(D)J recombination
Mutations, déficiences => ?
Impact de mutation dans les gènes NHEJ
Protéine activité Gène
Voie
/interactions
Cellule
Homme
Souris
XRCC4
Ku 80
Mutants de Ku 70
gènes NHEJ
Ø  IRS
DNA-PKcs
Ø  [SCID]
DNA ligase IV
Artemis
SCID = Severe Combined Immune Deficiency in mouse
Thacker & Zdzienicka (2005) DNA Repair 4: 303
Absence des protéines du NHEJ dans lignées cellulaires
15 min
Post IR
24h
Post IR
wild-type
DSB
•  induites par rayons X (2Gy) •  visualisées dans les cellules par marquage
Mesure de la non réparation des DSB induites
fluorescent de gH2AX par rayons X au cours du temps et dans
•  24h après IR + de foyers dans les mutants de
différents mutants du NHEJ : ATM ou Artemis que dans les cellules sauvages
WT > ATM-/- > DNA-PKcs-/- > lig4-/-
Löbrich & Jeggo (2005) DNA Repair 4: 749
Souris déficientes dans les gènes du NHEJ
Phénotypes différents:
Ø  DNA-PKcs -/- ~WT
Ø  Ku -/- petites et vieillissent prématurément
Ø  XRCC4 -/-, DNA ligase IV -/- sont létales embryonnairement
(apoptose des neurones nouvellement générés)
Comment expliquer la différence?
Ø  DNA-PKcs -/-, Ku -/
Ø  XRCC4 -/-, DNA ligase IV -/
pas de NHEJ bascule possible vers une autre voie de recombinaison : HR
DSB bloquée par Ku/DNA-PKcs
extrémités non accessibles aux HR
Déficience des gènes du NHEJ chez les humains
Imprécision du NHEJ peut contribuer au vieillissement
Seulement 15% des humains SCID sont porteurs d une mutation
dans les gènes du NHEJ et sont mutés dans le gène Artemis.
Défaut dans la recombinaison V(D)J : translocations chromosomiques qui peuvent être la cause de cancers.