Transcript Ispitivanje osjetljivosti bakterija prema kemoterapeuticima

ANTIMIKROBNA
TERAPIJA
ISPITIVANJE OSJETLJIVOSTI
PREMA KEMOTERAPEUTICIMA
Blaženka Hunjak,
Hrvatski zavod za javno zdravstvo
Osnovni pojmovi :

antimikrobni lijekovi

antibiotici

kemoterapeutici
anti –protiv
bios – život
“Nešto protiv života”
Povijesni pregled






1.-3.st NAROD MAYA: “ljekovite plijesni” liječenje kožnih bolesti i intestinalnih
infekcija
12.st.TEMPLARI: “ljekovite plijesni”
1896 Ernest Duchense proučava gljivu Penicillium crysogenum
otkrio pozitivna djelovanja i terapijske mogućnosti gljive
1907. – Paul Erlich : uveo termin KEMOTERAPIJA
ARSEFANAMIN tj. “ SALVARSAN”- uspješna terapija sifilisa
1923. Picado Twight Kostarika – antibiotičko djelovanje gljive Penicillium
criysogenum
POČETAK ERE ANTIBIOTIKA
1929. A. Fleming- otkrio djelovanje plijesni Penicillium
notatum na stafilokoke
Povijesni pregled
1932. objavljeno 1935. Gerhard Domagk – iz
sintetske boje prontosil
razgradnjom dobiven produkt
SULFANILNAMID - prvi sulfonamidi –
UČINAK NA STREPTOKOKNE I
GONOKOKNE INFEKCIJE
1939. / 1940. Florey i Chain pročistili ekstrakt
plijesni, izolirali produkt
Otkrili da je antibiotik dovoljno jak da preživi u
čovječjem tijelu uz zadržavanje antibiotske
mogućnosti i aktivno djelovanje protiv
patogenih mikroorganizama
NOBELOVA NAGRADA
1943. Selman A. Waksman - prvi
aminoglikozid-streptomicin lijek protiv TBC
SVOJSTVA IDEALNOG
ANTIBIOTIKA


MORA DJELOVATI NA MIKROORGANIZME U VRLO NISKIM
KONCENTRACIJAMA
NJEGOVO DJELOVANJE SE U UVJETIMA BOLESTI NE SMIJE
SMANJIVATI: UPALA,PRISUTNOST IgG, MEDIJATORA UPALE,
STANIČNIH ELEMENTATA

MORA DJELOVATI BRZO

NE SMIJE POTICATI REZISTENCIJU

NE SMIJE NARUŠAVATI IMUNI SUSTAV ORGANIZMA

POIZVODANJA MORA BITI MOGUĆA U INDUSTRIJSKIM MJERILIMA

CIJENA NE PREVISOKA
VRSTE ANTIBIOTIKA I
MEHANIZMI DJELOVANJA











A. PREMA MEHANIZMU DJELOVANJA NA :
1. sintezu staničnog zida bakterije
2. sintezu proteina bakterije
3. sintezu nukleinske kiseline bakterije
4. metabolizam bakterije
B. PREMA NAČINU DJELOVANJA
baktericidni - antibiotici koji potpuno uništavaju
mikroorganizam
bakteriostatski - antibiotici koji zaustavljaju rast
mikroroganizma.
C.PREMA KEMIJSKOJ STRUKTURI
MEHANIZMI DJELOVANJA
OMETANJE STVARANJA STANIČNOG ZIDA
1.BETALAKTAMSKI ANTIBIOTICI
PENICILINI,CEFALOSPORINI,KARBAPENEMI MONOBAKTAMI
2.GLIKOPEPTIDI
VANKOMICIN,TEIKOPLANIN
INHIBICIJA SINTEZE BJELANČEVINA
1.AMINOGLIKOZIDI
GENTAMICIN,TOBRAMICIN,AMIKACIN,NETILMICIN,
STREPTOMICIN,SPEKTINOMICIN
2.KLORAMFENIKOL
3.TETRACIKLINI
OKSITETRACIKLIN,TETRACIKLIN,DOKSICIKLIN,MINOCIKLIN
4.MAKROLIDI
ERITOMICIN,AZITROMICIN,ROKSITROMICIN,KLARITROMICIN
MEHANIZMI DJELOVANJA
INHIBICIJA SINTEZE NUKLEINSKIH KISELINA
INHIBICIJA DNA-GIRAZE
KINOLONI
NALIDIKSIČNA KISELINA
NORFLOKSACIN,OFLOKSACIN,LEVOFLOKSACIN,PEFLO
KSACIN,
CIPROFLOKSACIN
KOMPETITIVNI ANTAGONIZAM
SULFONAMIDI
MEHANIZAM DJELOVANJA
ANTIMIKROBNOG LIJEKA
ODREĐUJE
MEHANIZAM REZISTENCIJE
MIKROORGANIZMA.
Penicilini su antibiotici koji se dobivaju iz filtrata kulture
plijesni Penicillium notatum i Penicillium chrysogenum.


Kemijska osnova svih penicilina jest 6-aminopenicilanska kiselina.
Mijenjanjem supstituenta na aminoskupini dobivamo sve ostale
peniciline.
1.PENICILINI
A. PRIRODNI




benzilpenicilin-kalij (penicilinG)
prokainpenicilin G
benzatin benzilpenicilin
benzatin fenoksimetilpenicilin(penicilin V)
Spektar
 Gram-pozitivni uzročnici:streptokoki i stafilokoki ,
menigokoki,gonokoki,aktinomicete,leptospire, anaerobni
Gramm pozitivni koki, klostridji (osim Clostridium difficile)
anaerobni gram negativni štapići ( osim Bacteroides fragilis)
Corynebacterium diphteriae, Treponema pallidum, Pasterella
multocida,Borrelia burgdorferi, Erysipelotrix rusiopathiae,
Spirrilum minus
1.PENICILINI
B. OTPORNI NA PENICILINAZU




oksacilin
kloksacilin
dikloksacilin
meticilin
Spektar


Staphylococcus aureus koji stvara penicilinazu,
koagulaza negativni stafilokoki
MRSA - meticilin rezistentni Staphylococcus aureus
OTPORAN NA METICILIN, ALI I NA SVE ČLANOVE
OVE SKUPINE
2. AMINOPENICILINI




ampicilin
amoksicilin
penicilini širokog spektra
djeluju i na G - negativne bakterije
Spektar

streptokoki,stafilokoki, Neisseria meningitidis, Haemophylus
influenzae, gonokok , enterokoki /u kombinaciji s
amnoglikozidima/, klostridije, Listeria monocytogenes

slabiji učinak na:E.coli, Proteus mirabilis, salmonele i šigele.
3.UREIDOPENICILINI



azlocilin
mezlocilin
piperacilin
Spektar

Pseudomonas aeruginosa,E. coli,Proteus
mirabilis,Haemophylus influenzae,
enterokok,salmonele, šigele.
4.ß -LAKTAMI +
INHIBITORI ß - LAKTAMAZA




amoksicilin + klavulanska kiselina
ampicilin + sulbaktam
tikarcilin + klavulanska kiselina
piperacilin + tazobaktam
Spektar

mikroroganizmi koji luče beta-laktamaze:-
S.aureus,M.catarrhalis,H.influenzae,Klebsiella,
P.vulgaris,P.mirabilis E.coli,gonokoki,B.fragilis
CEFALOSPORINI




Podjela cefalosporina na generacije
1.prema učinku na gram-negativne
bakterije
2. otpornosti prema ß-laktamazama
SVAKA NOVA GENERACIJA IMA
BOLJA SVOJSTVA
CEFALOSPORINI
I GENERACIJA
cefaleksin
cefazolin
cefalotin
Spektar
streptokoki, ß-laktamaza negativni sojevi
Staphylococcus aureus, N. gonorrhoeae,
Neisseria meningitidis, E.coli,
Klebsiella pneumoniae
CEFALOSPORINI
II GENERACIJA
cefuroksim aksetil
cefuroksim
cefaklor
cefmetazol
cefotetan
umjerena otpornost prema širokom spektru beta-laktamaza gram-negativnih
bakterijâ;
Spektar
E.coli, Klebsiella spp.
gram-pozitivni koki,Shigella,Proteus,
N.gonorrhoeae,H.influenzae
CEFAMICINI
Cefoksitin
Spektar
kao cefalosporini + anaerobi
CEFALOSPORINI
III GENERACIJA
cefotaksim
ceftriakson
ceftazidim
cefoperazon
cefiksim,ceftibuten – PERORALNA PRIMJENA
Spektar
otporni na širok spektar ß - laktamaza.
E.coli, Klebsiella sp., H.influenzae,pseudomonas,
pneumokok, menigokok, gonokok
CEFALOSPORINI
IV GENERACIJA
Cefpirom
Cefepim
Spektar
 Zbrojeni učinak I i II generacije
MONOBAKTAMI

Aztreonam
Spektar
 Gram - negativni uzročnici: enterobakterije,
gonokok, meningokok, Haemophylus
influenzae,Pseudomonas
aeruginosa,jersinija,aeromonas.

Lijek izbora kod bolesnika preosjetljivih na
penicilne i cefalosporine.
KARBAPENEMI


imipenem s cilastatinom
meropenem
Spektar
 djeluju na većinu G+ i G- bakterija, uključuju i
anaerobe


cilastatin - onemogućava razgradnju imipenema,
sprječava toksični učinak imipenema
meropenem - nije potreban inhibitor cilastatin
GLIKOPEPTIDI


vankomicin
teikoplanin
Spektar
 MRSA,E.faecium,Corynebacterium
jeikeum,

Clostridium
difficile,propionibakterije,listerije
AMINOGLIKOZIDI







gentamicin
netilmicin
kanamicin
amikacin
tobramicin
spektinomicin
streptomicin
Spektar

- enterobakterije, pseudomonas, za gram pozitivne bakterije
u kombinaciji s ß-laktamskim antibioticima
KLORAMFENIKOL
TETRACIKLINI

KLORAMFENIKOL
SPEKTAR

pneumokok,menigokok, Haemophylus influenzae,streptokoki.Slabije
djelovanje na stafilokoke, enterokoke,salmonele,šigele,enterobaktere.

TETRACIKLINI
tetraciklin

oksitetraciklin

metaciklin

doksiciklin

minociklin
Spektar

bruceloza,kolera, tularemija, kuga,rikecioza,leptospiroza, klamidijske i
mikoplazmatske infekcije, pertusis sindrom. Sekundarni izbor za liječenje
gonoreje, sifilisa, aktinomikoze, listerioza.

MAKROLIDI/AZALIDI





eritromicin
midekamicin
azitromicin
klaritromicin
roksitromicin
Spektar
 sličan benzilpenicilinu uz dodatak djlovanja na
legionele, mikoplazme,rikecije,
helikobakter,klamidije,većina G+ uzročnika,
Neisseria spp,Haemophylus,influenzae, moraksele,
anaerobi.
LINKOZAMINI


linkomicin
klindamicin
Spektar
 anaerobi, stafilokoki,streptokoki.

klindamicin-alternativni lijek kod bolesnika
preosjetljivih na ß-laktame.
KINOLONI
FLUORIRANI KINOLONI:
 norfloksacin
 pefloksacin
 ofloksacin
 enoksacin
 ciprofloksacin
 sparfloksacin
 grapfloksacin
Spektar

učinak na višestruko rezistentne
enterobakterije:E.coli,proteus,klebsijela,enterobakter,salmonela,
šigela,kampilobakter,gonokok,
mikoplazme,klamidije,legionelu,mikobakterije.
SULFONAMIDI U KOMBINACIJAMA

sulfametoksazol+trimetoprim
Spektar
 enterobakterije,Pneumocystis jiroveci
(prije:carinii ),salmonele,
šigele,nokardije,Stenotrophomonas
maltophilia, Pseudomonas spp. (osim
Ps. aeruginosa)
OSTALI ANTIBIOTICI
metronidazol
 mebendazol
 tinidazol
 ornidazol
Spektar
 B.fragilis i ostali anaerobi,Garderella
vaginalis,kampilobakter, anaerobni G+
koki,Trichomonas vaginalis, amebe,
enterobijusi

ANTITUBERKULOTICI
izoniazid+piridoksin

rifampicin

etambutol

pirazinamid

streptomicin

etionamid

PAS

kapreomicin

cikloserin

klofaztimin
Spektar




Mycobacterium tuberculosis,M cansasii,M.avium intracelluare
rifampicin : ima djelovanje na stafilokok, legionelu, klamidije, M.leprae,
meningokok,gonokok i H.influenzae
streptomicin: antibakterijsko djelovanje: M.tbc,brucele, Yersinia pestis,
Francisella tularensis, stafilokok, streptokok
Određivanje osjetljivosti
mikroorganizama na antimikrobne
lijekove
TEMELJEM REZULTATA TESTOVA ODREĐUJE SE
DA LI JE MIKROORGANIZAM
Osjetljiv
Umjereno osjetljiv ili umjereno otporan
Otporan
NA DJELOVANJE IZABRANOG ANTIBIOTIKA
Određivanje osjetljivosti
mikroorganizama na antimikrobne
lijekove

Testiraju se :

IZBOR ANTIBIOTIKA
OVISI O:

MIKROORGANIZMU:
vrsti
poznatoj rezistenicji
DA!!!
KLINIČKI ZNAČAJNI IZOLATI
BAKTERIJE KOJE NEMAJU
PREDVIDLJIVU
OSJETLJIVOST
NE!!!
FIZIOLOŠKA FLORA
KONTAMINANTE





ANTIBIOTIKU:
vrsti
mehanizmu djelovanja
načinu izlučivanja
djelotvornosti
METODE ISPITIVANJA OSJETLJIVOSTI
BAKTERIJA NA ANTIBIOTIKE




METODE DILUCIJE
1. dilucija u bujonu
mikrodilucija
makrodilucija
2. dilucija u agaru
ODREĐUJU NAJNIŽU
KONCENTRACIJU
ANTIBIOTIKA KOJA
SPRJEČAVA RAST
BAKTERIJA

DIFUZIJSKA METODA

1.disk difuzija
DOBRO STANDARDIZIRANA
ZA BRZO RASTUĆE
FAKULTATIVNO,ANAEROBNE
BAKTERIJE
Kombinacija difuzijske metode i
određivanja MIK-a
E-TEST
Metoda prijelomne točke
“BREAK_POINT”
METODE ISPITIVANJA OSJETLJIVOSTI
BAKTERIJA NA ANTIBIOTIKE
METODE DILUCIJE
1.dilucija u bujonu

- epruvete ili bazenčići-identični volumen

bujona s inokulumom bakterije






- identičnim volumenom otopine
antibiotika, čije se koncentracije
povećavaju geometrijski
CILJ METODE
- utvrditi MIK -najnižu koncentracije antibiotika, koja
sprečava rast bakterija,
tj. minimalnu inhibitornu koncentraciju
Metoda mikro - dilucije
Metoda makro - dilucije
Određivanje MIK-a
 MIK
koncentracija antibiotika koja
se nalazi u prvoj epruveti u
kojoj nema vidljivog rasta
bakterija
Određivanje MBK
POSTUPAK:
iz epruveta u kojima nema vidljivog rasta bakterija
subkultivacija na krutu podlogu bez antibiotika
MBK- minimalna baktericidna koncentracija
koncentracija antibiotika na prvoj ploči na kojoj
nema vidljivog rasta bakterija je MBK
najmanja koncentracija koja ubija određenu
bakteriju
KONCENTRACIJE ANTIBIOTIKA
64
32
16
8
4
2
MBK - prva ploča na kojoj nema porasta nakon subkultivacije
METODE DILUCIJE
2.dilucija u agaru




u krutu / polukrutu podlogu
- antimikrobni lijek čije se koncentracije
geometrijski povećavaju
–identični bakterijski inokulum
CILJ METODE
određivanje MIK-a
najniže koncentracije antibiotika koja sprečava rast bakterija
MIK - koncentracija antibiotika koja se nalazi u prvoj
podlozi na kojoj nema vidljivog rasta
bakterija
METODA PRIJELOMNE TOČKE
(„ BREAK-POINT“)







specifične vrijednosti parametara poput MIK-ova ili promjera
zone inhibicije.
antibiotici se testiraju samo u specifičnim koncentracijama
koje omogućavaju svrstavanje u kategorije"S","I","R".
Kada se izaberu dvije koncentracije (viša i niža), interpretiraju
se rezultati:
bakterija rezistentna - rast bakterije na obje koncentracije
bakterija intermedijarno osjetljiva - rast samo na nižoj
koncentraciji
bakterija osjetljiva - nema porasta niti na jednoj koncentraciji.
METODA DISK - DIFUZIJE
PRINCIP METODE
omogućava testiranje osjetljivosti pomoću
očitavanja inhibicijskih zona oko diskova
impregniranih antibioticima
DIJAMETRI ZONA INHIBICIJE KORELIRAJU
sa
MIK- ovima BAKTERIJA.
Dispenzori za aplikaciju diskova
na Petrijevu ploču
METODA DISK - DIFUZIJE
ZONA INHIBICIJE

područje bez rasta bakterija,

rezultat je inhibitornog učinka antibiotika na bakteriju, koji je
difundirao u medij iz apliciranog izvora.



dijametar zone inhibicije mjeri se u mm.
mjeriti prozirnim ravnalom zone kompletne inhibicije uključujući
dijametar diska
očitane vrijednosti svrstati u kategorije
osjetljiv- S, intermedijaran - I, rezistentan -R
interpretirati prema NCCLS standardu
IZRADA TESTA OSJETLJIVOSTI BAKTERIJA NA
ANTIBIOTIKE METODOM DISK - DIFUZIJE
Priprema inokuluma

uzeti sterilnom ezom 3-5 kolonija iste morfologije i prirediti suspenziju u

fiziološkoj otopini gustoće 0,5 Mc Farlanda (usporediti sa standardom )
Inokulacija

unutar 15 minuta od priređivanja suspenzije, sterilni vateni štapić umočiti

u suspenziju,






prisloniti ga uz stijenke da se ocijedi višak tekućine, te inokulirati ploču
agara tako da se pokrije čitava površina. Tijekom inokulacije okretati
ploču za 60° nekoliko puta.
ploče ostaviti poluotvorene 3-5 minuta, ali ne dulje od 15 minuta, kako bi
suspenzija natopila agar
Nanošenje antibiotskih
diskova
dispenzorom ili ručno nanijeti diskove tako da je razmak
između diskova 24 mm, mjereći od centra do centra diska

unutar 15 minuta od postavljanja diskova, ploče okrenuti i
staviti u temostat na 37º C
testiranje bakterija s posebnim zahtjevima rasta
(Haemophylus spp, Neisseria spp.)

inkubacija u atmosferi sa 5-7% CO2
Očitavanje
testova osjetljivosti







- nakon 16 - 18 sati (osim za izolate stafilokoka i
enterokoka nakon 24 sata, zbog rezistencije
na vankomicin i oksacilin ) očitati zone oko diskova
- očitavati obrnutu stranu ploče iznad crne, nereflektirajuæe
površine, koja je odozgo osvjetljena
- ako je podlozi dodana krv, očitavati pravu stranu ploče s otkrivenim
poklopcem

- mjeriti prozirnim ravnalom zone kompletne inhibicije uključujući
dijametar diska
- očitane vrijednosti svrstati u kategorije
(osjetljiv- S, intermedijaran - I, rezistentan -R)

- interpretirati prema NCCLS standardu



Očitavanje antibiograma
mjerenjam zona
Automatsko očitavanje antibiograma
E-TEST
Primjena



za testiranje osjetljivosti bakterija za koje nisu
standardizirane metode disk difuzije
za bakterije koje zahtijevaju posebne uvjete rasta
(anaerobne bakterije, Streptococcus pneumoniae,
Haemophylus influenzae, Neisseria spp.)
kod bakterija za koje disk difuzija pokazuje
dvojbene rezultate ili su visoko rezistentne.
E-TEST
PRINCIP METODE
na plastičnim test trakama
koncentracije antibiotika
OČITAVANJE
koncentracija antibiotika
koja inhibira rast bakterije
očitava se direktno sa skale
na traci na mjestu gdje rast
mikroorganizma u obliku
elipse siječe test traku
E-TEST SA 5 TRAKA
E-test
očitavanje vrijednosti koncentracije antibiotika
na mjestu koje siječe rast bakterije
(strelica)
UPOTREBA KOMBINACIJA ANTIBIOTIKA




a) INDIFERENTNI UČINAK - kombinacija antibiotika međusobno ne
povećava, niti ne smanjuje
antibakterijski
učinak








b) SINERGIZAM - kombinacija antibiotika djeluje zajednički –
povećava
se antibakterijski učinak
aminoglikozidi + beta-laktamski antibiotici
c) ANTAGONIZAM – kombinacija antibiotika smanjuje
antibakterijski učinak svakog lijeka u kombinaciji
imipenem i cefalosporini III generacije
Prikaz sinergističkog djelovanja antibiotika
Hvala na pažnji!